Cas12a2 löst durch RNA eine fehlgeschlagene Infektion aus

Nov 06, 2023

Nature Band 613, Seiten 588–594 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Bakterielle abortive Infektionssysteme begrenzen die Ausbreitung fremder Eindringlinge, indem sie infizierte Zellen abschalten oder abtöten, bevor sich die Eindringlinge vermehren können1,2. Mehrere auf RNA gerichtete CRISPR-Cas-Systeme (d. h. Typ III und VI) verursachen abortive Infektionsphänotypen, indem sie wahllose Nukleasen aktivieren3,4,5. Ein CRISPR-vermittelter Abortmechanismus, der die wahllose DNase-Aktivität einer RNA-gesteuerten Einzeleffektor-Nuklease nutzt, muss jedoch noch beobachtet werden. Hier berichten wir, dass das RNA-Targeting durch die Typ-V-Einzeleffektornuklease Cas12a2 eine abortive Infektion durch unspezifische Spaltung doppelsträngiger DNA (dsDNA) vorantreibt. Nach der Erkennung eines RNA-Ziels mit einer aktivierenden Protospacer-flankierenden Sequenz baut Cas12a2 effizient einzelsträngige RNA (ssRNA), einzelsträngige DNA (ssDNA) und dsDNA ab. Innerhalb von Zellen löst die Aktivierung von Cas12a2 eine SOS-DNA-Schadensreaktion aus und beeinträchtigt das Wachstum, wodurch die Verbreitung des Eindringlings verhindert wird. Schließlich nutzten wir die Begleitaktivität von Cas12a2 für den direkten RNA-Nachweis und zeigten, dass Cas12a2 als RNA-gesteuertes RNA-Targeting-Tool umfunktioniert werden kann. Diese Erkenntnisse erweitern die bekannten Abwehrfähigkeiten von CRISPR-Cas-Systemen und schaffen zusätzliche Möglichkeiten für CRISPR-Technologien.

Alle Lebensbereiche nutzen Abwehrstrategien, die dazu führen, dass Zellen in den Ruhezustand übergehen oder absterben, um die Ausbreitung von Infektionserregern zu begrenzen1. Bei Bakterien und Archaeen wird diese Strategie als abortive Infektion bezeichnet und von einer Vielzahl bakterieller Abwehrsysteme genutzt1,2. Kürzlich wurde gezeigt, dass CRISPR-RNA (crRNA)-gesteuerte adaptive Immunsysteme, die auf RNA abzielen, Phänotypen abortiver Infektionen verursachen3,4,5,6. Typ-VI-Systeme bauen RNA unspezifisch ab, wobei die Cas13-Einzeleffektor-Nuklease sowohl als crRNA-gesteuerter Effektor als auch als wahllose RNase fungiert3,7,8. In Typ-III-Systemen löst die Ziel-RNA-Bindung die Produktion von zyklischen Oligoadenylat-Sekundärbotenstoffen aus, die wiederum wahllose akzessorische RNasen und ssDNasen aktivieren, die eine fehlgeschlagene Infektion auslösen können4,5,9,10,11. Darüber hinaus wurde vorgeschlagen, dass eine abortive Infektion durch wahllose dsDNasen (wie NucC) vermittelt wird, die durch sekundäre Botenstoffe vom Typ III12,13 aktiviert werden, oder durch wahllose ssDNase-Aktivität von Cas12a-Einzeleffektor-Nukleasen vom Typ V14. Die CRISPR-vermittelte dsDNase-Aktivität vom Typ III muss jedoch noch in vivo untersucht werden, und kürzlich wurde gezeigt, dass die ssDNase-Aktivität von Cas12a keine abortive Infektion verursacht15.

Hier berichten wir, dass Cas12a2, eine Typ-V-Einzeleffektor-CRISPR-assoziierte (Cas) Nuklease, einen Phänotyp einer abortiven Infektion induziert, wenn sie mit Plasmiden in Kontakt kommt, die zu crRNA-Guides komplementär sind. Biochemische Tests mit rekombinantem Protein ergaben, dass Cas12a2 RNA-Ziele erkennt und unspezifische dsDNA-, ssDNA- und ssRNA-Nukleaseaktivitäten freisetzt, die sich von denen anderer RNA-Targeting-Aktivitäten auf einzelne Untereinheiten (wie Cas13a) und dsDNA-Targeting (wie Cas12a) unterscheiden ) Cas-Nukleasen8,16,17. Darüber hinaus zeigen wir, dass die unspezifischen Nukleaseaktivitäten von Cas12a2 die bakterielle DNA schädigen, die SOS-Reaktion auslösen und das Zellwachstum beeinträchtigen. Insgesamt legen diese Ergebnisse nahe, dass die dsDNase-Aktivität von Cas12a2 maßgeblich an der Auslösung des Phänotyps einer abortiven Infektion beteiligt ist. Als Beweis des Prinzips zeigen wir, dass Cas12a2 RNA bei verschiedenen Temperaturen mit einer Empfindlichkeit nachweisen kann, die mit der der RNA-zielenden Cas13a-Nuklease vergleichbar ist.

Cas12a2 umfasst eine Gruppe von Typ-V-Effektornukleasen, die mit Cas12a16 verwandt sind, wobei Cas12a2-Orthologe zuvor als Cas12a-Varianten klassifiziert wurden18. Unsere Analysen ordnen sie in ähnlicher Weise einer monophyletischen Gruppe zu, die den letzten gemeinsamen Vorfahren mit Cas12a-Nukleasen teilt (Abb. 1a und erweiterte Daten, Abb. 1). Weitere Analysen ergaben, dass CRISPR-Cas12a2- und CRISPR-Cas12a-Systeme CRISPR-Wiederholungen mit einem konservierten 3'-Ende aufweisen und die Nukleasen homologe RuvC-Endonukleasedomänen und eine ähnliche vorhergesagte Sekundärstruktur in den N-Termini besitzen (Abb. 1b und ergänzende Abb. 2). . Trotz der konservierten RuvC-ähnlichen Domänen und N-Termini unterscheidet sich Cas12a2 von Cas12a durch das Vorhandensein einer großen Domäne unbekannter Funktion anstelle der Cas12a-Brückenhelix sowie einer Zinkfingerdomäne anstelle der Cas12a-Nuc-Domäne ( Abb. 1b und ergänzende Abb. 2). Unter Berücksichtigung ihrer ursprünglichen Klassifizierung in Kombination mit unseren phylogenetischen Analysen sowie aktuellen Strukturergebnissen19 haben wir diese unterschiedlichen Typ-V-Nukleasen Cas12a2 genannt.

a, Maximum-Likelihood-Phylogenie identifizierter Cas12a2-Nukleasen mit Cas12a- und Cas12b-Nukleasen. Die detaillierte Phylogenie ist in Abb. 1 der erweiterten Daten dargestellt. Systeme mit gleichzeitig vorkommendem Cas12a2 und Cas12a werden durch ausgefüllte rote und blaue Kreise angezeigt. SuCas12a2 ist durch einen ungefüllten roten Kreis gekennzeichnet. b, Die Domänenarchitektur von SuCas12a2 im Vergleich zu LbCas12a. aa, Aminosäuren. c: Ausgerichtete direkte Wiederholungen, die mit repräsentativen Cas12a2- und Cas12a-Nukleasen assoziiert sind. Die fett gedruckten Nukleotide geben konservierte Positionen innerhalb der verarbeiteten Wiederholungen für beide Nukleasen an. Die vorhergesagte Pseudoknotenstruktur der Cas12a-Wiederholung ist unten dargestellt. Die Schleife der Haarnadel (grau) ist variabel. Die Prä-crRNA-Verarbeitung durch SuCas12a2 ist in Extended Data Abb. 3 dargestellt. d, Genorganisation von CRISPR-Cas-Systemen innerhalb repräsentativer genomischer Loci, die Cas12a2 kodieren. Beispiele für Systeme, die Cas12a2 als einzige Cas-Nuklease kodieren, und solche, die auch Cas12a kodieren, werden gezeigt. e, Diagramm des traditionellen (oben; Ziel-Nuklease-Auswahl (tns)) und modifizierten (unten; Nuklease-Auswahl (ns)) Plasmid-Interferenz-Assays. Cm, Chloramphenicol; Kan, Kanamycin. f, Die Verringerung der Plasmidtransformation für SuCas12a2 und LbCa12a2 unter Zielplasmid- und Nukleaseplasmidselektion. g, Die Verringerung der Plasmidtransformation von SuCas12a2 RuvC-Mutanten unter Zielplasmid- und Nukleaseplasmidselektion. Für f und g sind die Daten Mittelwerte ± Standardabweichung von mindestens drei unabhängigen Experimenten, die mit getrennten Kolonien begonnen wurden. P-Werte wurden mithilfe einseitiger Welch-t-Tests berechnet; NS, P > 0,05; *P < 0,05, **P < 0,005.

Bemerkenswert ist, dass einige CRISPR-Cas-Systeme sowohl cas12a2- als auch cas12a-Gene nebeneinander neben einem gemeinsamen CRISPR-Array enthalten (Abb. 1c). Aufgrund dieser Beobachtung und der Konservierung von CRISPR-Wiederholungen aus Systemen mit einer der Nukleasen (Abb. 1d und ergänzende Abb. 3) haben wir die Hypothese aufgestellt, dass beide Proteine ​​an ähnliche crRNA-Leiter binden und diese verarbeiten. Da die Proteine ​​jedoch in anderen Domänen voneinander abweichen, stellten wir außerdem die Hypothese auf, dass Cas12a2 eine Abwehrfunktion ausübt, die sich von der dsDNA-Targeting-Aktivität von Cas12a16 unterscheidet.

Um diese Hypothesen zu testen, haben wir das cas12a2-Gen aus dem schwefeloxidierenden Epsilonproteobacterium Sulfuricurvum sp. PC08-66 (SuCas12a2) zusammen mit einem CRISPR-Array in ein Expressionsplasmid, das wir in Escherichia coli-Zellen einführten. Als nächstes führten wir einen herkömmlichen Plasmid-Interferenztest durch, bei dem die Zellen durch Selektion nach dem Plasmid, das die Nuklease und crRNA enthält, sowie nach einem Zielplasmid abgereichert werden (Abb. 1e). Dieser Assay erkennt eine breite Aktivität des Immunsystems, kann jedoch nicht zwischen Abwehraktivitäten, die nur das Ziel schwächen, und solchen, die Phänotypen abortiver Infektionen aktivieren, unterscheiden. Um zu testen, ob Cas12a2 einen abortiven Infektionsmechanismus verwendet, haben wir den Assay modifiziert, indem wir nur das Nukleaseplasmid ausgewählt haben (Abb. 1e). In Übereinstimmung mit unserer Hypothese, dass Cas12a2 im Vergleich zu Cas12a anders funktioniert, depletierte Cas12a2 Zellen sowohl im traditionellen (etwa 1.900-fache Reduktion) als auch im modifizierten (etwa 1.300-fache Reduktion) Plasmidinterferenztest, während Cas12a aus dem Lachnospiraceae-Bakterium (LbCas12a) nur depletierte Zellen enthielt im traditionellen Assay (Abb. 1f). Ähnliche Trends wurden bei unterschiedlichen Zielen beobachtet, die in die gleiche Plasmidposition kloniert wurden, bei unterschiedlichen Cas12a2-Homologen und beim Vergleich von SuCas12a2 mit dem Cas12a-Homolog aus Prevotella bryantii B14 (Pb2Cas12a) (Extended Data Abb. 2a, b). Darüber hinaus beeinträchtigte die Mutation vorhergesagter aktiver Reste innerhalb eines der drei RuvC-Motive in SuCas12a2 die Immunfunktion (Abb. 1g). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Cas12a2 auf einer RuvC-Nukleasedomäne beruht und eine abortive Infektion durch einen Mechanismus induziert, der sich von dem von Cas12a unterscheidet.

CRISPR-Systeme, die abortive Infektionsphänotypen (wie Typ III und VI) verursachen, basieren auf wahllosen Nukleasen, die durch RNA-Targeting aktiviert werden3,4,5. Um festzustellen, ob Cas12a2 einen ähnlichen Mechanismus verwendet, haben wir SuCas12a2 rekombinant exprimiert und gereinigt und seine enzymatischen Aktivitäten in vitro getestet (Abb. 2 und ergänzende Abb. 4). Bevor wir jedoch die Nukleinsäure-Targeting-Aktivitäten untersuchten, mussten wir bestimmen, wie Cas12a2-cRNAs verarbeitet werden.

a, Direktes Targeting verschiedener FAM-markierter Nukleinsäuresubstrate durch einen gereinigten SuCas12a2-crRNA-Komplex. b, Kollaterale Spaltung von FAM-markierten Nicht-Ziel-Nukleinsäuresubstraten durch den SuCas12a2-crRNA-Komplex mit verschiedenen Ziel-RNA-Substraten nach 1 Stunde. Ziel-RNA, eine nicht selbstflankierende Sequenz am 3′-Ende; Selbstflanke, eine flankierende Sequenz, die zum umgekehrten Komplement des crRNA-Repeat-Tags mutiert ist; keine Flanke, nur das umgekehrte Komplement des crRNA-Guides. Für a und b sind rechts Diagramme von Ziel- und Nicht-Ziel-Nukleinsäuren dargestellt. c, Zeitverlaufsanalyse der RNA-ausgelösten Kollateralspaltung von markierter Nicht-Ziel-RNA, ssDNA oder dsDNA. Repräsentative Gelbilder finden Sie in Extended Data Abb. 4c. Beachten Sie, dass dsDNA doppelt so viel ssDNA-Substrat enthält wie RNA und ssDNA, aber die gleiche Konzentration an markierten Strängen. d, Die Auswirkung der Mutation jedes der drei RuvC-Motive auf die durch RNA ausgelöste Kollateralspaltung von dsDNA. e, Zeitverlaufsanalyse der RNA-ausgelösten Kollateralspaltung von Nicht-Ziel-Plasmid-DNA. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung von Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Für a–d geben die Sternchen ein FAM-markiertes Substrat an, und die Diagramme auf der rechten Seite geben die Substrate an. Alle Ergebnisse sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Daten zur Gelquelle finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1.

Die CRISPR-Wiederholungen der Cas12a- und Cas12a2-Systeme sind am 3'-Ende hoch konserviert (Abb. 1d und ergänzende Abb. 3), und Sequenzausrichtungen sagen voraus, dass Cas12a2 eine gemeinsame Sekundärstruktur in der Region des aktiven Zentrums der Cas12a-Prä-crRNA-Verarbeitung aufweist ,20 (Ergänzende Abbildung 5). In Übereinstimmung mit dieser Vorhersage ergab die RNA-Sequenzanalyse von prä-crRNAs, die von SuCas12a2 in vitro verarbeitet wurden, dass die Verarbeitung ein Nukleotid stromabwärts der von Cas12a gespaltenen Position erfolgt (Extended Data Abb. 3a, b). Das 3'-Ende des Spacers wurde in vivo ebenfalls getrimmt, um eine etwa 24 Nukleotide lange Führung zu bilden (Extended Data Abb. 3b, c), möglicherweise durch Wirts-Ribonukleasen, wie für Cas9-crRNAs 21 beobachtet. Mutierende basische Aminosäuren (Lys784 und Arg785), die sich im vorhergesagten aktiven Zentrum der RNA-Verarbeitung befinden, führten zu einer Aufhebung der Aktivität 22 (Extended Data Abb. 3d). Darüber hinaus ergaben Plasmid-Interferenztests, dass Cas12a und Cas12a2 Guides austauschen können, ohne die Immunität zu beeinträchtigen (Extended Data, Abb. 2c). Somit verarbeitet die Cas12a2-Nuklease ihre eigenen crRNA-Guides wie andere Typ-V-Effektor-Nukleasen20,23 und kann crRNAs mit Cas12a teilen.

Um die Nukleinsäure-Zielpräferenz von crRNA-gesteuertem Cas12a2 zu bestimmen, wurden komplementäre ssRNA-, ssDNA- und dsDNA-Substrate, die eine A/T-reiche flankierende Sequenz enthielten (parallele Cas12a-Substrate)16,22, mit einem FAM-Molekül fluoreszierend markiert und mit crRNA kombiniert. geführtes Cas12a2 (Abb. 2a). Ähnlich wie CRISPR-Cas-Systeme, die eine abortive Infektion verursachen – jedoch im Gegensatz zum dsDNA-zielenden Cas12a – wird Cas12a2 nur in Gegenwart komplementärer RNA-Ziele aktiviert. Die Stärke der Plasmidinterferenz mit SuCas12a2 (Abb. 1f) war bemerkenswert, da in diesem Konstrukt kein definierter Promotor stromaufwärts des Ziels vorhanden war. Wir führen die Interferenz jedoch aus zwei Gründen auf eine falsche Transkription des kodierenden Plasmids zurück: Die Einführung eines Upstream-Terminators reduzierte die Plasmidinterferenz in E. coli erheblich (Extended Data Abb. 2d, e) und ein Upstream-Promotor war erforderlich, um die Kollateralaktivität in zu erkennen ein zellfreier Transkriptions-Translations-Assay24 (Extended Data Abb. 2f, g).

Da andere Cas-Abort-Infektionsmechanismen auf einer kollateralen wahllosen RNase-Aktivität beruhen, haben wir untersucht, ob das spezifische RNA-Targeting durch Cas12a2 eine wahllose Nuklease-Aktivität induziert. Wir fanden heraus, dass SuCas12a2 FAM-markierte ssRNA-, ssDNA- und dsDNA-Substrate, die keine Komplementarität zum crRNA-Leitfaden aufweisen, robust und wahllos abbaut. Im Gegensatz dazu bauen andere Cas-Nukleasen wahllos nur ssRNA (Cas13a)8 oder ssRNA und ssDNA (Cas12g)25 nach dem RNA-Targeting oder nur ssDNA nach dem dsDNA-Targeting (Cas12a)14 ab (Abb. 2b und erweiterte Daten Abb. 4a). Von den drei Kollateralsubstraten scheinen ssRNA und ssDNA durch Cas12a2 effizienter gespalten zu werden als dsDNA (Abb. 2c und Extended Data Abb. 4b). Dieser Unterschied könnte jedoch durch das Vorhandensein doppelt so vieler DNA-Stränge in dsDNA-Substraten im Vergleich zu ssDNA-Substraten bei gleicher Nukleasemenge erklärt werden. Ähnlich wie Cas13a8 aktivieren komplementäre ssDNA und dsDNA keine Cas12a2-unspezifische Nukleaseaktivität (Extended Data Abb. 4a), und dsRNA ist kein primäres Substrat der Kollateralspaltung (Extended Data Abb. 4c).

Um zu untersuchen, ob die Cas12a2-Aktivität von der Erkennung eines „nicht-selbst“-Signals neben dem Ziel abhängt (sogenannte Protospacer-flankierende Sequenz (PFS))8, führten wir In-vitro-Spaltungstests durch, bei denen Ziel-RNA-Sequenzen auf der 3′-Seite flankiert wurden. Seite mit einer „selbst“-Sequenz, die zum crRNA-Repeat komplementär ist (5′-AUCUA-3′), dem in unserem In-vivo-Assay verwendeten nicht-selbst-PFS (5′-GAAAG-3′) oder einer „flanklosen“ RNA, die dazu komplementär ist die Leitregion der crRNA, enthält jedoch kein PFS (Abb. 2b). Bemerkenswert ist, dass nur das RNA-Ziel die nicht-eigene PFS-aktivierte kollaterale Nukleaseaktivität enthält, was zeigt, dass spezifische Nukleotide am 3′-Ende des RNA-Ziels vorhanden sein müssen, um die kollaterale Aktivität von Cas12a2 zu aktivieren. Darüber hinaus wurden durch die Einführung störender Mutationen in eines der drei RuvC-Motive oder konservierte Cysteinreste innerhalb der mutmaßlichen Zinkfingerdomäne alle unspezifischen Spaltungen aufgehoben (Abb. 2d und erweiterte Daten Abb. 4d), was mit unseren In-vivo-Plasmidinterferenzergebnissen übereinstimmt ( Abb. 1g).

Unsere biochemischen Tests zeigten, dass Cas12a2 eine FAM-Markierung schnell von linearen dsDNA-Substraten entfernen konnte, es war jedoch unklar, ob Cas12a2 DNA abbaut, denen verfügbare 5′- oder 3′-Enden fehlen. Wir haben daher crRNA-gesteuertes Cas12a2 mit einem RNA-Ziel und einem superspiralisierten pUC19-Plasmid herausgefordert. Wichtig ist, dass pUC19 keine Sequenz enthält, die zum Cas12a2-crRNA-Leitfaden komplementär ist. Wir beobachteten, dass SuCas12a2 pUC19-DNA schnell spaltete, linearisierte und abbaute (Abb. 2e), jedoch nur in Gegenwart eines verwandten Ziels und PFS und mit einer intakten RuvC-Domäne (Extended Data Abb. 4e). Diese schnelle Zerstörung des superspiralisierten Plasmids steht im Gegensatz zur langsamen und unvollständigen Linearisierung der Plasmid-DNA durch Cas12a-Nukleasen26. Diese Daten deuten auf einen Mechanismus hin, bei dem aktiviertes SuCas12a2 in der Lage ist, das Phosphodiester-Rückgrat unspezifischer DNA robust zu hydrolysieren, unabhängig davon, ob es superspiralisiert, geknickt oder linear ist. Ein Vergleich mit Cas12a (dsDNA-Targeting mit kollateraler ssDNase), Cas13a (ssRNA-Targeting mit kollateraler ssRNase) und Cas13g (ssRNA-Targeting mit kollateraler ssRNase und ssDNase) zeigte, dass die RNA-targeting ssRNase, ssDNase und dsDNase einzigartig für SuCas12a2 sind (Extended Data Abb . 4a). Insgesamt zeigen diese In-vitro-Ergebnisse, dass crRNAs SuCas12a2 zu RNA-Zielen leiten und die RuvC-abhängige Spaltung von ssRNA, ssDNA und dsDNA aktivieren. Diese Aktivitäten können teilweise oder vollständig dem Phänotyp der abortiven Infektion zugrunde liegen.

Obwohl unsere In-vitro-Daten auf einen zugrunde liegenden Mechanismus für den Cas12a2-Phänotyp der abortiven Infektion hinwiesen, wollten wir die Targeting-Einschränkungen dieser unterschiedlichen Enzyme verstehen. Insbesondere untersuchten wir die Stringenz der nicht-selbst-PFS-Sequenzerkennung und die Strafen für Fehlpaarungen zwischen crRNA und Ziel. Wir haben SuCas12a2 daher mit einer Bibliothek von Plasmiden herausgefordert, die alle möglichen 1.024 flankierenden Sequenzen am 3'-Ende des RNA-Ziels bis zur −5-Position kodieren (Abb. 3a und Extended Data Abb. 5a, b). Wir fanden heraus, dass SuCas12a2 etwa die Hälfte aller Sequenzen in der Bibliothek aufgebraucht hat, was auf einen PFS-Erkennungsmechanismus hindeutet, der strenger als der von Cas13, aber immer noch promiskuitiver ist als die der meisten DNA-Targeting-Systeme8,27. Die abgereicherten Sequenzen waren im Allgemeinen A-reich und stimmten mit einem 5'-GAAAG-3'-PFS überein, konnten jedoch nicht vollständig von einem einzelnen Konsensmotiv erfasst werden (Abb. 3a und erweiterte Daten Abb. 5c). Wir haben einzelne abgereicherte Sequenzen weiter validiert, einschließlich Vertretern innerhalb von fünf einzigartigen Motiven, die von SuCas12a2, jedoch nicht von Pb2Cas12a erkannt werden – einer Nuklease, die für die flexible PAM-Erkennung bekannt ist (Abb. 3b und Extended Data Abb. 5d). In Übereinstimmung mit seiner Funktion als RNA-Targeting-Nuklease waren die erkannten Sequenzen breit, folgten jedoch nicht dem erwarteten Profil, wenn Cas12a2 hauptsächlich die Tag-Anti-Tag-Komplementarität bewertet. Diese Ergebnisse stützen weiterhin einen Mechanismus, bei dem die PFS-Erkennung durch SuCas12a2 ähnlich wie Typ-III-Systeme funktioniert, die zur Aktivierung die Erkennung eines PFS oder RNA-PAM erfordern28,29,30,31 und sich von der Bewertung der Tag-Anti-Tag-Komplementarität unterscheidet, die von RNA verwendet wird -Targeting auf Cas138,32 und andere CRISPR-Cas-Systeme vom Typ III33.

a, Experimentell bestimmte PFSs und Motive, die von SuCas12a2 in E. coli erkannt werden. Motive, die die Positionen −4 bis −1 des PFS erfassen, werden angezeigt und mit 3′ bis 5′ geschrieben. B steht für C, G oder U; K steht für G oder U; R steht für G oder A; W steht für A oder U; und Y steht für C oder U. Die Ergebnisse sind repräsentativ für zwei unabhängige Bildschirme (Erweiterte Daten, Abb. 5). b, Validierung ausgewählter PFSs, die im Screen identifiziert wurden und das Targeting durch SuCas12a2, aber nicht durch Pb2Cas12a zulassen. c, Die Auswirkung von Guide-Fehlpaarungen auf das Plasmid-Targeting durch SuCas12a2 in E. coli. d, Das Ausmaß der Hemmung durch bekannte AcrVA-Proteine ​​gegen SuCas12a2. Es wurde bestätigt, dass Acr-Proteine ​​eine inhibitorische Aktivität gegen verschiedene Cas12a-Homologe in E. coli oder in zellfreien Transkriptions-Translations-Reaktionen aufweisen (Extended Data, Abb. 5). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von mindestens drei unabhängigen Experimenten, die mit getrennten Kolonien begonnen wurden. Die statistische Analyse wurde mit einseitigen Welch-T-Tests durchgeführt.

Die meisten auf DNA und RNA gerichteten Cas-Nukleasen haben eine hohe Empfindlichkeit gegenüber Fehlpaarungen innerhalb einer Samenregion gezeigt, bei denen eine einzelne Fehlpaarung zwischen der crRNA-Führung und dem Ziel die Bindung stört8,17,34,35. Um herauszufinden, ob SuCas12a2 auf einer Samenregion beruht, haben wir in unserem zellbasierten Assay untersucht, wie SuCas12a2 Fehlpaarungen toleriert (Abb. 3c). Bemerkenswert ist, dass SuCas12a2 einzelne und doppelte Fehlpaarungen im gesamten Ziel berücksichtigte, wobei PFS-distale Mutationen stärker nachteilige Auswirkungen auf das Plasmid-Targeting hatten. Um das SuCas12a2-Targeting vollständig zu unterbrechen, waren vier Fehlpaarungen im gesamten Leitfaden (Abb. 3c) oder bis zu 10 Fehlpaarungen am 3'-Ende eines 24-Nukleotid-Leitfadens erforderlich (Extended Data, Abb. 6a). Die flexible PFS-Erkennung und eine Toleranz gegenüber Guide-Target-Fehlpaarungen deuten darauf hin, dass SuCas12a2 eine promiskuitive Zielerkennung aufweist und offenbar keinen kanonischen Seed besitzt, der überempfindlich auf Guide-Target-Fehlpaarungen reagiert34,35. Die notwendige Paarung mit dem 3′-Ende des Leitfadens steht jedoch im Einklang damit, dass dieses Ende in der Struktur des crRNA-Cas12a2-Binärkomplexes19 vorgeordnet ist und möglicherweise eine Basenpaarung mit dem Ziel initiiert. Darüber hinaus ermöglichte die Promiskuität SuCas12a2 die Erkennung von Zielmutationen, die das Targeting von Cas12a stören (Extended Data, Abb. 6b).

Insgesamt lassen die unterschiedlichen Aktivitäten von Cas12a2 im Vergleich zu Cas12a darauf schließen, dass Tandemsysteme, die beide Nukleasen besitzen (Abb. 1d), kooperativ wirken und die Wirksamkeit gegen fremde Viren und Plasmide erhöhen könnten. Insbesondere stellten wir die Hypothese auf, dass die einzigartigen Strukturmerkmale von Cas12a2 das Entweichen von Viren verhindern könnten, die Anti-CRISPR-Proteine ​​codieren, die die Cas12a-Funktion blockieren36,37,38. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese konnte nur eines (AcrVA2.1) von sieben Cas12a-Anti-CRISPR-Proteinen die Cas12a2-Funktion beeinträchtigen, wenn auch nur teilweise (Abb. 3d und ergänzende Abb. 6a, b). Bemerkenswerterweise zeigte AcrVA5 auch keine inhibitorische Aktivität, obwohl SuCas12a2 den konservierten Lysinrest in Cas12a besaß, der durch dieses Acr chemisch modifiziert wurde, um die PAM-Erkennung zu blockieren (Abb. 3d und ergänzende Abb. 6c). Die begrenzte Fähigkeit der Cas12a-Acr-Proteine, SuCas12a2 zu hemmen, unterstreicht die unterschiedlichen Eigenschaften dieser Nukleasen und die Fähigkeit von Cas12a und Cas12a2, sich bei der Immunabwehr gegenseitig zu ergänzen.

Obwohl unsere ersten Ergebnisse darauf hindeuten, dass Cas12a2 einen Phänotyp einer abortiven Infektion verursacht, ging ein Szenario davon aus, dass Cas12a2 selektiv alle Plasmide eliminierte, was es den Zellen ermöglichte, jeder eingeführten Antibiotika-Selektion zu unterliegen. Um diese Möglichkeit zu bewerten, haben wir das Wachstum von E. coli in Flüssigkultur unter verschiedenen Antibiotika-Auswahlbedingungen (einschließlich einer Bedingung ohne Antibiotika) nach Induktion von SuCas12a2 und LbCas12a mithilfe einer zielgerichteten crRNA untersucht (Abb. 4a und ergänzende Abb. 7). SuCas12a2, aber nicht LbCas12a, unterdrückte das Kulturwachstum ohne Plasmidselektion, was die Induktion eines Phänotyps einer abortiven Infektion durch Cas12a2 weiter unterstützt.

a, E. coli-Wachstumsstopp in Gegenwart des SuCas12a2-, LbCas2a2- oder LsCas13a-Plasmids unter verschiedenen Targeting-Bedingungen und Antibiotika-Regimen. A600, Absorption bei 600 nm. b, Der Prozentsatz der mit Propidiumiodid (PI) gefärbten E. coli-Zellen, was auf einen Lebensfähigkeitsverlust vor dem Targeting (nicht induziert) und nach 4 Stunden Targeting (induziert) ohne Antibiotikaauswahl hinweist. Die Gating-Strategie ist in der ergänzenden Abbildung 7 dargestellt. c, Das unterschiedliche Ausmaß des RNA-Abbaus in E. coli durch SuCas12a2, LbCas12a oder LsCas13a2 2 Stunden nach der Induktion ohne Antibiotikaauswahl. Die Ergebnisse stellen doppelte unabhängige Experimente dar. Siehe Erweiterte Daten Abb. 7 für unabhängige Vierfache. Der kleine RNA-Pool umfasst tRNAs und andere kleine RNAs. d, SOS-responsive Expression von GFP in E. coli nach 4 Stunden Plasmid-Targeting durch SuCas12a2, LbCas12a oder LsCas13a ohne Antibiotika-Selektion. Zeitverlaufsdaten sind in der ergänzenden Abbildung 9 dargestellt. RFU, relative Fluoreszenzeinheiten. e, Relativer DNA-Gehalt in E. coli nach 4 Stunden Targeting durch SuCas12a2, LbCas12a oder LsCas13a ohne Antibiotikaauswahl. Die Fluoreszenz und Zellgröße von 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) wurden mittels Durchflusszytometrie gemessen. Jeder Kreis oder jedes Paar vertikal ausgerichteter Kreise stellt Hauptsubpopulationen desselben biologischen Replikats dar. Die entsprechenden Konturdiagramme sind in Extended Data Abb. 8 dargestellt. FSC, Vorwärtsstreuung. f, RNA-Nachweisassay. Die Grenze des RNA-Nachweises mit Cas12a2, inkubiert mit einem ssRNA-Beacon bei Raumtemperatur (RT). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten. g, Nukleinsäureziele und Reporter sowie die unverstärkte Nachweisgrenze (LOD) für Cas12a2 und andere Cas-Detektoren46. Aap, Alicyclobacillus acidiphilus; Lwa, Leptotrichia wadei; Lbu, Leptotrichia buccalis. h, Das vorgeschlagene Modell für promiskuitives RNA-Targeting und Kollateralabbau durch SuCas12a2 und seine Wirkung auf die Zelle. Für b und d sind die Daten Mittelwerte ± Standardabweichung von vier unabhängigen Experimenten, die mit getrennten Kolonien begonnen wurden. Die statistische Analyse wurde mit einseitigen Welch-T-Tests durchgeführt. NT, Nicht-Zielplasmid; T, Zielplasmid.

Eine offene Frage ist, ob der Phänotyp der abortiven Infektion durch Zellruhe oder Zelltod verursacht wurde. Kürzlich wurde gezeigt, dass Cas13a nach der Erkennung eines RNA-Ziels einen weit verbreiteten RNA-Abbau vermittelt, der die Zellruhe fördert und eine Phageninfektion unterdrückt3. Wir haben daher das repräsentative Cas13a aus Leptotrichia shahii (LsCas13a) in unseren Flüssigkulturtest eingeführt. Ähnlich wie SuCas12a2 unterdrückte LsCas13a das Wachstum auch ohne Plasmidselektion (Abb. 4a und ergänzende Abb. 7).

Unser Vergleich mit LsCas13a deutete darauf hin, dass die Wachstumsunterdrückung durch SuCas12a2 durch unspezifische RNA-Spaltung erfolgen könnte, was zu einer Zellruhe führt, wohingegen unsere In-vitro-Daten darauf hindeuteten, dass unspezifische dsDNA-Spaltung auch das Wachstum unterdrücken könnte, indem sie Zelltod verursachte. Um zu beurteilen, ob die Zellen, die SuCas12a2 enthielten, einen Zelltod erlitten, führten wir einen Zelllebensfähigkeitstest mit Propidiumiodid sowohl für Cas12a2 als auch für Cas13a durch. Wir beobachteten sowohl für Cas12a2 als auch für Cas13a nach 4 Stunden nur einen geringen Prozentsatz (ca. 10 %) des Zelltods (Abb. 4b und ergänzende Abb. 8). Obwohl die wahllosen Nukleaseaktivitäten von Cas12a2 einen gewissen Zelltod verursachen, lässt sich das primäre Ergebnis der Cas12a2-Aktivität besser als Phänotyp der Zellruhe beschreiben.

Obwohl Cas12a2 eine Ruhephase zu verursachen scheint, war unklar, welche der verschiedenen wahllosen Nukleaseaktivitäten daran beteiligt sind. Um festzustellen, ob SuCas12a2 durch RNA-Spaltung eine Ruhephase verursacht, wurden die gesamten zellulären RNAs unter Targeting- und Nicht-Targeting-Bedingungen untersucht. Während Cas13a sowohl rRNAs als auch den kleinen RNA-Pool (einschließlich tRNAs) signifikant dezimierte, dezimierte Cas12a2 nur den kleinen RNA-Pool signifikant (Abb. 4c und Extended Data Abb. 7).

Angesichts der beobachteten Unterschiede im RNA-Abbau unter Targeting-Bedingungen untersuchten wir, ob die wahllose dsDNase-Aktivität von SuCas12a2 im Zusammenhang mit dem Phänotyp der abortiven Infektion nachweisbar war. Wir kamen zu dem Schluss, dass durch SuCas12a2 verursachte weit verbreitete dsDNA-Schäden eine SOS-Reaktion auslösen würden, die das Wachstum beeinträchtigt40,41. In Übereinstimmung mit dieser Behauptung induzierte das Plasmid-Targeting unter Verwendung von SuCas12a2 die GFP-Expression von einem SOS-responsiven Reporterkonstrukt im Vergleich zu einer Nicht-Zielkontrolle signifikant, wohingegen LbCas12a und LsCas13a die GFP-Expression vernachlässigbar induzierten (Abb. 4d und ergänzende Abb. 9). Darüber hinaus zerfielen SuCas12a2-Targeting-Kulturen ohne Antibiotika-Selektion in zwei Subpopulationen: eine durch kompakte Zellen mit reduziertem DNA-Gehalt und eine durch filamentöse Zellen mit hohem DNA-Gehalt (Abb. 4e und Extended Data Abb. 8 und 9). Kulturen, die LbCas12a und LsCas13a exprimierten, zeigten keine merklichen Unterschiede in der Zellgröße und dem DNA-Gehalt für die Ziel- und Nicht-Zielplasmide. Frühere Studien mit anderen CRISPR-Cas-Systemen, die speziell auf das Bakterienchromosom abzielten, beobachteten ähnliche morphologische Veränderungen43,44,45, was darauf hindeutet, dass diese unterschiedlichen Morphologien auf dsDNA-Schäden zurückzuführen sind. Diese Ergebnisse zeigen, dass das RNA-Targeting durch SuCas12a2 eine dsDNA-Schädigung des Bakterienchromosoms verursacht, die wiederum die SOS-Reaktion und eine abortive Infektion bei Bakterien induziert, was einen ausgeprägten Immunitätsmechanismus widerspiegelt, der auf wahlloser dsDNase-Aktivität beruht. In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung zeigten aktuelle Kryo-Elektronenmikroskopie-Strukturen, dass Cas12a2 an dsDNA bindet und diese schneidet, und zwar über einen Mechanismus, der sich völlig von allen anderen CRISPR-assoziierten Nukleasen und strukturgesteuerten Mutanten mit beeinträchtigter in vitro kollateraler dsDNase, aber nicht ssRNase und ssDNase unterscheidet Aktivitäten haben die In-vivo-Abwehraktivität gegen Plasmide aufgehoben19.

CRISPR-Einzeleffektor-Nukleasen wurden für viele Anwendungen von der Genbearbeitung bis zur molekularen Diagnostik umfunktioniert. Um festzustellen, ob Cas12a2 als biotechnologisches Werkzeug umfunktioniert werden könnte, haben wir SuCas12a2 für den RNA-Nachweis ausgewählt. Wir programmierten Apo SuCas12a2 mit einem crRNA-Guide, der zu einem RNA-Ziel komplementär ist, und inkubierten den Komplex mit einem ssDNA- oder ssRNA-Beacon, der nach der Spaltung aufgrund der Trennung eines Fluorophors und eines Quenchers fluoresziert (Abb. 4f). Mit diesem Ansatz konnten wir RNA sowohl mit ssDNA- als auch mit ssRNA-Sonden bei 37 °C und Raumtemperatur nachweisen, wobei die Nachweisgrenze innerhalb des Bereichs lag, der für andere Cas-Nukleasen mit einer einzelnen Untereinheit beobachtet wurde46 (Abb. 4f und erweiterte Daten Abb. 10a). -C). Darüber hinaus haben wir einen modifizierten Nachweistest entwickelt, der Plasmid-DNA und DNA-Nick-Translation47 verwendet und so ein deutlich positives Ergebnis für die CRISPR-basierte Diagnostik einführt (Extended Data Abb. 10d–f). Diese Daten deuten darauf hin, dass Cas12a2 problemlos als Werkzeug für Anwendungen in Wissenschaft, Biotechnologie, Landwirtschaft und Medizin eingesetzt werden kann. Wir gehen davon aus, dass die einzigartigen Aktivitäten dieses Enzyms weiter genutzt werden können, um das CRISPR-basierte Toolkit zu erweitern.

Insgesamt stützen unsere Daten ein Modell, in dem Cas12a2-Nukleasen einen RNA-ausgelösten Abbau von zytoplasmatischer dsDNA und kleinen RNAs zeigen, was das Wachstum der Wirtszelle behindert und einen Phänotyp einer abortiven Infektion hervorruft (Abb. 4h). Dieser Mechanismus steht im Gegensatz zu gezielten Eindringlingsbeseitigungs- oder abortiven Infektionsaktivitäten, die bei anderen CRISPR-Cas-Systemen auftreten. Insbesondere erinnert der von Cas12a2 gezeigte Mechanismus an das kürzlich beschriebene CBASS-Abwehrsystem, das auf der wahllosen doppelsträngigen DNase NucC beruht, die die DNA der Wirtszelle abbaut und die Zelle tötet12. Bemerkenswert ist, dass einige Typ-III-Systeme NucC-Enzyme kodieren, was darauf hindeutet, dass sich andere CRISPR-Cas-Systeme konvergent entwickelt haben, um einen ähnlichen DNA-abbauenden abortiven Infektionsmechanismus zu nutzen13,48.

Neben der Schädigung des Genoms und der Auslösung der SOS-Reaktion weist SuCas12a2 durch ein flexibles PFS und eine Fehlpaarungstoleranz eine promiskuitive RNA-Erkennung auf. Diese Flexibilität bei der Zielerkennung spiegelt die Flexibilität der Tag-Anti-Tag-Komplementarität wider, die bei Systemen vom Typ III und VI beobachtet wird8,33 und könnte besonders vorteilhaft gegen sich schnell entwickelnde Phagen sein, obwohl Cas12a2-Orthologe charakterisiert werden müssen, um festzustellen, ob eine solche Promiskuität ein gemeinsames Merkmal von ist diese Nukleasen. Obwohl flexibel, würde das PFS dennoch die Selbsterkennung einer falschen Antisense-Transkription des CRISPR-Arrays verhindern, da der entsprechende PFS-haltige Teil der Wiederholung stark vom erkannten PFS abweicht – ein Standardmerkmal der Selbst-/Nichtselbsterkennung für PAMs in DNA -Targeting auf CRISPR-Cas-Systeme49. Die Flexibilität bei PFS und Zielerkennung könnte außerdem als Backup-Mechanismus dienen, wenn die präzise Erkennung und Clearance von DNA-Zielen durch Cas12a in Organismen fehlschlägt, die sowohl Cas12a als auch Cas12a2 neben einem einzelnen CRISPR-Array kodieren (Abb. 1a, d und erweiterte Daten). Abb. 1 und 6b). Diese Dual-Nuklease-Strategie wäre vergleichbar mit Bakterien, die mehrere CRISPR-Cas-Systeme kodieren und auf denselben Eindringling abzielen50. Es bedarf jedoch weiterer Forschung, um zu verstehen, wie diese beiden Nukleasen bei der Bekämpfung von Infektionen zusammenarbeiten.

Die Kombination aus Nuklease-vermittelter crRNA-Biogenese, RNA-Targeting und kollateraler Spaltung von ssRNA, ssDNA und insbesondere dsDNA unterscheidet Cas12a2 von anderen bekannten Cas-Nukleasen. Die offensichtliche Notwendigkeit, die A-reiche flankierende Sequenz durch SuCas12a2 zu erkennen, um die wahllose RuvC-Nukleaseaktivität zu aktivieren, weist stark darauf hin, dass Cas12a2 an ein korrektes PFS neben dem RNA-Ziel binden muss, um die Spaltung zu aktivieren, anstatt sich ausschließlich auf die Komplementarität zwischen dem Wiederholungs-Tag und dem Ziel zu verlassen Anti-Tag-Paar zur Unterscheidung von Selbst- und Nicht-Selbstsequenzen, typisch für mehrere andere auf RNA gerichtete Cas-Nukleasen und -Komplexe8,33,51,52. Die Untersuchung der zugrunde liegenden molekularen Basis der Zielerkennung und Aktivierung der Kollateralspaltung durch Cas12a2 könnte neue Mechanismen aufdecken, die von CRISPR-Nukleasen zur Unterscheidung zwischen eigenen und nicht-eigenen Zielen genutzt werden. Aktuelle kryoelektronenmikroskopische Strukturen von Cas12a2 in den Phasen des RNA-Targetings und der kollateralen dsDNA-Erfassung erfüllen diesen Bedarf bereits19.

Cas12a2 birgt erhebliches Potenzial für CRISPR-Technologien. Als Beweis des Prinzips haben wir gezeigt, dass SuCas12a2 für den RNA-Nachweis verwendet werden kann, wobei die Nachweisgrenze mit bestehenden Einzeleffektor-basierten Tools vergleichbar ist46. Über die Fähigkeit zum Nachweis von RNA hinaus stellen wir uns eine Vielzahl von SuCas12a2-Anwendungen vor, die das CRISPR-basierte Toolkit erweitern und verbessern. Die durch RNA ausgelöste dsDNA-Spaltung könnte die programmierbare Abtötung prokaryotischer und eukaryotischer Zellen mit verschiedenen Anwendungen ermöglichen, einschließlich der programmierbaren Gestaltung mikrobieller Gemeinschaften, Krebstherapeutika und Gegenselektion zur Verbesserung der Genombearbeitung. Darüber hinaus ist die Fähigkeit von Cas12a2 und Cas12a, dieselbe crRNA-Sequenz zu verwenden und dennoch unterschiedliche Nukleinsäurespezies (RNA gegenüber ssDNA und dsDNA) zu erkennen und unterschiedliche unspezifische Spaltungsaktivitäten hervorzurufen (ssRNA, ssDNA und dsDNA (Cas12a2) gegenüber ssDNA (Cas12a)) könnte bestehende Cas12a-Anwendungen durch die Integration von Cas12a2 erweitern. Durch die weitere Erforschung der Eigenschaften von SuCas12a2 und seinen Orthologen erwarten wir die Einführung neuer und verbesserter CRISPR-Technologien, die der Gesellschaft im Großen und Ganzen zugute kommen könnten.

Mehrere Cas12a2-Sequenzen wurden zunächst identifiziert und vorläufig als kodierende Cas12a-Nukleasen klassifiziert16. Diese Cas12a2-Proteinsequenzen wurden als Ausgangspunkt für BLASTp-Suchen von Proteindaten in NCBI und für tBLASTn-Suchen von metagenomischen Daten in NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) und JGI (https://img.jgi) verwendet .doe.gov), um weitere mutmaßliche Cas12a2-Nukleasen zu identifizieren.

Die Aminosäuresequenzen der Cas12a2-, Cas12a- und Cas13b-Orthologen wurden mit MAFFT (v.7.490)53 abgeglichen. Das resultierende Alignment wurde mit ClipKIT54 zugeschnitten und zur Erstellung einer Maximum-Likelihood-Phylogenie mit RAxML-NG55 mit den folgenden Parametern verwendet: --model JTT+G --bs-metric fbp, tbe --tree pars{60}, rand{60 } --seed 12345 --bs-trees autoMRE. Cas13b-Sequenzen wurden als Außengruppe verwendet. Die bei der Erstellung der Phylogenie verwendeten Aminosäuresequenzen sind in der Ergänzungsdatei 1 aufgeführt.

Konservierte Motive in SuCas12a2 wurden mithilfe von MOTIF Search (https://www.genome.jp/tools/motif/, abgerufen am 15. Juni 2021) und Phyre 256 (abgerufen am 8. März 2021) identifiziert. HHpred-Sekundärstrukturvorhersagen von orthologen Cas12a2-Aminosäuresequenzen wurden durchgeführt, um die gemeinsame Sekundärstruktur zwischen Cas12a2 und Cas12a zu identifizieren, die die crRNA-Verarbeitungsstelle von Cas12a257 vorhersagte.

Alle In-vivo-Experimente wurden, sofern nicht anders angegeben, in E. coli BL21(AI) durchgeführt. Zur Vermehrung wurden die Kulturen in LB-Medium bei 37 °C unter ständigem Schütteln bei 225–250 U/min gezüchtet. Der E. coli-Stamm TOP10 wurde für die Plasmidklonierung verwendet (Ergänzungstabelle 1 (Tab. 1)). Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Primer, gBlocks und Oligos von Integrated DNA Technologies bezogen. Der Gibson-Zusammenbau der Plasmidkonstruktion wurde unter Verwendung des NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (New England Biolabs, E2621) durchgeführt. Die Mutagenese der Plasmide, einschließlich kleiner Insertionen und Nukleotidsubstitutionen, wurde unter Verwendung des Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit (New England Biolabs, E0554S) durchgeführt. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Nukleasen zusammen mit crRNA von Plasmiden exprimiert, die den p15A-Replikationsursprung und einen Chloramphenicol-Resistenzmarker enthielten. Die Expression der Nukleasen und der crRNA wurde, sofern nicht anders angegeben, durch einen T7-Promotor kontrolliert. Alle Ziel- und Nicht-Zielplasmide wurden durch Einführung von Protospacersequenzen und entsprechenden flankierenden Sequenzen in pBR322- oder sc101-Replikationsursprungsplasmide mit einer Kanamycin-Resistenzkassette erstellt, sofern nicht anders angegeben. Sequenzen, die Cas12a2-Orthologe kodieren (Ergänzungsdatei 1), wurden von Genscript codonoptimiert und synthetisiert. Sequenzen, die Pb2Cas12a von P. bryantii B14 (NCBI: WP_039871282), LbCas12a von L. bacterium ND2006 (NCBI: WP_035635841.1), FnCas12a von Francisella tularensis (NCBI: WP_104928540.1), AsCas12a von Acidaminoco kodieren ccus sp. BV3L6 (NCBI: WP_021736722.1) und Mb3Cas13a aus Moraxella bovoculi (NCBI: WP_080946945.1)16 wurden für die Expression in E. coli codonoptimiert und als gBlocks bei Integrated DNA Technologies bestellt. Sequenzen, die für Anti-CRISPR-Proteine ​​36, 38 (Ergänzungstabellen 1 und 3) kodieren, wurden für die Expression in E. coli codonoptimiert und als gBlocks bei Integrated DNA Technologies bestellt. Die acr-Gene wurden dann PCR-amplifiziert und in das pBAD24-Plasmidrückgrat eingeführt, das eine Ampicillin-Resistenzkassette trägt58. Das LsCas13a-kodierende Plasmid pCBS2091 wurde bei Addgene (79150)8 bestellt. Zum Nachweis der RecA-abhängigen SOS-Reaktion in E. coli BL21(AI) wurden die Reporterplasmide pCBS2000, pCBS3611 und pCBS3616 durch Einführung des recA-Promotors erstellt, der 100 bp stromaufwärts der vorhergesagten LexA-Bindungsstelle und stromaufwärts des GFP-kodierenden Gens enthalten war in das Plasmid pCBS198. Die Plasmide pCBS3611 und pCBS3616 erhielten eine Ampicillin-Resistenzkassette vom Plasmid pCB67224. Die recA-Promotorsequenz wurde im Genom von E. coli BL21(AI) zwischen den Positionen 2.635.525 und 2.635.347 identifiziert (NCBI: CP047231.1). Die Kontrollplasmide pCBS3616 und pCBS2002 ohne die GFP-Reportergene wurden durch PCR-Amplifikation von pCBS2000 und pCBS3616 und anschließende KLD-Assemblierung (New England Biolabs, M0554) erzeugt. Eine vollständige Liste der in der Studie verwendeten Plasmide, einschließlich Links zu Plasmidkarten, finden Sie in den Ergänzungstabellen 1 und 2. Eine Liste relevanter Oligonukleotid-, dsDNA- und RNA-Sequenzen finden Sie in den Ergänzungstabellen 1 und 3.

N-terminale 6×His-markierte SuCas12a2-WT- und mutierte Konstrukte wurden in E. coli-Nico21(DE3)-Zellen aus einem pACYC-Plasmid exprimiert, dem entweder (apo) fehlte (Plasmid 1416) oder ein CRISPR-Array mit drei Spacern (crRNA-gesteuert) enthielt. (Plasmid 1408) entweder durch Autoinduktion oder durch Isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG)-Induktion. Das Autoinduktionswachstum wurde gemäß zuvor veröffentlichten Richtlinien durchgeführt59. Kurz gesagt, eine Lösung mit empfohlenen Konzentrationen an ZY-Medien, MgSO4, Metallmischung, 5052 (0,5 % Glycerin, 0,05 % Glucose, 0,2 % α-Lactose) und NPS-Autoinduktionspuffern sowie den für die Selektion erforderlichen Antibiotika wurde mit Bakterien aus einem Glycerin beimpft Bestand oder eine frische Transformation. Die Zellen wurden 5 Stunden lang bei 37 °C unter Schütteln bei etwa 250 U/min gezüchtet und dann auf 24 °C gebracht, wo sie 24 Stunden lang inkubiert wurden, bevor sie durch 25-minütige Zentrifugation bei 8.000 U/min gesammelt wurden. Anschließend wurden die Zellpellets bis zur Reinigung bei –80 °C gelagert. Für die IPTG-Induktion wurde 1 l TB-Medium mit 20 ml Übernachtwachstum beimpft und bei 37 °C gezüchtet, bis eine optische Dichte bei 600 nm (OD600) von 0,6 erreicht wurde. Anschließend wurden die Zellen 15 Minuten lang einem Kälteschock auf Eis ausgesetzt und mit 0,1 mM IPTG induziert, gefolgt von einer 16–18-stündigen Inkubation bei 18 °C. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt. Die Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung in Lysepuffer (25 mM Tris pH 7,2, 500 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 2 mM MgCl2, 10 % Glycerin) in Gegenwart von Leupeptin, Aprotinin, Pepstatin, AEBSF und Lysozym lysiert. Das Lysat wurde durch 35-minütige Zentrifugation bei 36.400 g geklärt. Das geklärte Lysat wurde zu 5 ml Ni-NTA-Harz gegeben und 30 Minuten lang bei 4 °C diskontinuierlich gebunden und dann mit 100 ml Lysepuffer gewaschen. Das Protein wurde mit 50 ml Ni-Elutionspuffer (25 mM Tris pH 7,2, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazol, 2 mM MgCl2, 10 % Glycerin) eluiert. Fraktionen, die SuCas12a2 enthielten, wurden mit der Entsalzungssäule Hiprep 26/10 in Puffer mit niedrigem Salzgehalt (25 mM Tris-pCas12a22, 50 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 10 % Glycerin) entsalzt. SuCas12a2 + crRNA wurde dann auf eine Hitrap Q HP-Säulen-Anionenaustauschsäule aufgetragen, während der Apo-SuCas12a2 auf eine Hitrap SP HP-Kationenaustauschsäule aufgetragen wurde. Die Säule wurde mit 10 % Puffer mit hohem Salzgehalt (25 mM Tris pH 7,2, 1 M NaCl, 2 mM MgCl2, 10 % Glycerin) gewaschen, gefolgt von einer Gradientenelution mit 100 % Puffer mit hohem Salzgehalt, 10 CV (50 ml). Die SuCas12a2 enthaltenden Fraktionen wurden mit einem 100-kDa-MWKO-Konzentrator auf etwa 1 ml konzentriert und dann durch Größenausschluss-Säulenchromatographie über eine Hiload 26/600 Superdex 200 pg-Säule, äquilibriert in SEC-Puffer (100 mM HEPES pH 7,2, 150 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 % Glycerin). Die SuCas12a2 enthaltenden Fraktionen wurden konzentriert und bei –80 °C gelagert.

Zur Verarbeitung einer 3×-Prä-crRNA wurde SuCas12a2-Prä-CRISPR×3-RNA in vitro mit dem HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs) transkribiert. Die Matrizen-DNA wurde vom Jackson Laboratory-Plasmid 1409 abgeleitet, das mit dem Restriktionsenzym KpnI linearisiert wurde. Als Artefakt der Reaktion wurde eine kontaminierende Bande beobachtet, die etwa bei 130 Nukleotiden verläuft. Es wurden zahlreiche Strategien versucht, die Transkription dieser kontaminierenden Bande zu verhindern, jedoch ohne Erfolg. In vitro transkribierte RNA wurde unter Verwendung von RNeasy-Spin-Säulen (Qiagen) gereinigt. Dann wurden 1,5 μM Apo SuCas12a2 mit 1 mg SuCas12a2-Prä-CRISPR×3-RNA in 1× 3,1-Puffer von New England Biolabs (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100 mg ml−1 BSA) inkubiert pH 7,9) und für verschiedene Zeiten bei 25 °C inkubiert. Die Proben wurden auf einem Gel (12 % Polyacrylamid, 8 M, TBE) entlang einer ssRNA-Low-Range-Leiter (New England Biolabs) laufen gelassen und mit SYBR-Gold (Thermo Fisher Scientific) gefärbt.

Zur Verarbeitung einer 1×-crRNA mit WT- und crRNA-verarbeitenden Mutanten wurde eine synthetische crRNA mit einem 13 Basen langen 5′-unverarbeiteten Überhang (smcrRNA; Ergänzungstabellen 1 und 3) unter Verwendung eines zuvor beschriebenen Protokolls neu gefaltet. In einer 10-μl-Reaktion wurden 150 nM crRNA-Substrat mit 1,5 μM WT-, K784A- oder K785A-Apo-SuCas12a2-Protein in NEB 3.1 kombiniert. Die Reaktionen wurden 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Die Reaktionen wurden mit Phenol gestoppt und eine Phenol-Chloroform-Extraktion durchgeführt. Die Ergebnisse wurden mit 12 % Harnstoff-PAGE, gefärbt mit SYBR Gold, analysiert.

Zur Analyse der gezielten Spaltung wurden 10 μl-Reaktionen von 250 nM SuCas12a2-crRNA mit 100 nM komplementärem FAM-markiertem synthetischen Oligonukleotid (d. h. ssDNA, dsDNA oder RNA) in 1 × NEB 3.1-Puffer 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert . Die Reaktionen wurden mit Phenol gequencht und anschließend wurde eine Phenol-Chloroform-Extraktion durchgeführt. Die Ergebnisse wurden mit einer zuvor beschriebenen FDF-PAGE-Methode61 analysiert und auf Fluorescein-Fluoreszenz hin sichtbar gemacht.

Zur Analyse der Kollateralspaltung werden 10 μl Reaktionen von 250 nM SuCas12a2-crRNA und 250 nM Zielsubstrat (RNA, die zum crRNA-Guide komplementär ist) oder Nicht-Zielsubstrat (RNA, die nicht zum crRNA-Guide komplementär ist) und 100 nM verwendet 5′-FAM-markiertes Kollateralsubstrat (ssDNA, dsDNA, RNA) in 1× NEB 3.1 wurde 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Die Reaktionen wurden mit Phenol gequencht und anschließend wurde eine Phenol-Chloroform-Extraktion durchgeführt. Die Ergebnisse wurden mit 12 % Harnstoff-PAGE analysiert und anhand der Fluorescein-Fluoreszenz sichtbar gemacht.

Zur Analyse der Anforderungen an die flankierende Sequenz für die Aktivierung wurden 10-μl-Reaktionen von 250 nM Cas12a2-crRNA mit 300 nM verschiedener Ziel-ssRNAs (selbst (flankiert durch eine Sequenz, die zur direkten Wiederholung der crRNA komplementär ist), keine Flanken und Flanken, die a enthalten 5′-GAAA-3′-PFS auf der 3′-Seite des Protospacers) und 100 nM kollaterale 5′-FAM-dsDNA in 1 × NEB 3.1-Puffer wurden 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Die Reaktionen wurden mit Phenol gestoppt und eine Phenol-Chloroform-Extraktion durchgeführt. Die Ergebnisse wurden mit 12 % Harnstoff-PAGE analysiert und anhand der Fluorescein-Fluoreszenz sichtbar gemacht.

Für die kinetische Analyse der Kollateralspaltung wurde eine einzelne 100-μl-Reaktion mit 100 nM Cas12a2-crRNA, 100 nM Ziel-ssRNA (crRNA-komplementär) und 100 nM verschiedener 5′-FAM-markierter Kollateralsubstrate (ssDNA, dsDNA, RNA) in 1× durchgeführt NEB 3.1-Puffer wurde erstellt. Zeitpunkte wurden bei 1, 2, 5, 10, 15, 30, 60, 120 und 180 Minuten ermittelt, indem 10 μl aus der 100 μl-Reaktion mit Phenol kombiniert und anschließend eine Phenol-Chloroform-Extraktion durchgeführt wurden. Die Ergebnisse wurden mit 12 % Harnstoff-PAGE analysiert und anhand der Fluorescein-Fluoreszenz sichtbar gemacht.

Für den Plasmidspaltungsassay wurde eine 100-μl-Reaktion mit 14 nM Cas12a2-crRNA, 25 nM Ziel-RNA und 7 nM pUC19-Plasmid in 1 × NEB 3.1-Puffer bei 37 °C inkubiert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden 10 μl der Reaktion entfernt und mit Phenol gequencht, und es wurde eine Phenol-Chloroform-Extraktion durchgeführt. Die Reaktionen wurden auf 1 % Agarose mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht.

EnGen LbaCas12a (LbCas12a) wurde von New England Biolabs (M0653S) gekauft. Reaktionen (10 μl), die 250 nM LbCas12a und 500 nM seiner zugehörigen crRNA in 1× NEB 2.1-Puffer enthielten, wurden bei 37 °C mit 200 nM verschiedener Zielsubstrate (ssDNA, dsDNA, RNA) und 100 nM verschiedener FAM- markierte Kollateralsubstrate (ssDNA, dsDNA, RNA). Nach einer Stunde wurden die Reaktionen durch Phenol gestoppt und eine Phenol-Chloroform-Extraktion durchgeführt. Die Ergebnisse wurden mit 12 % Harnstoff-PAGE analysiert und anhand der Fluorescein-Fluoreszenz sichtbar gemacht.

LwCas13a wurde von MCLAB Molecular Cloning Laboratories (Cas13a-100) erworben. Reaktionen (10 μl), die 250 nM LwCas13a und 500 nM seiner zugehörigen crRNA im bereitgestellten 1 × Cas9-Puffer (20 mM HEPES (pH 6,5), 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 100 μM EDTA) enthielten, wurden bei 37 °C inkubiert C mit 200 nM verschiedener Zielsubstrate (ssDNA, dsDNA, RNA) und 100 nM verschiedener FAM-markierter Kollateralsubstrate (ssDNA, dsDNA, RNA). Nach einer Stunde wurden die Reaktionen durch Phenol gestoppt und eine Phenol-Chloroform-Extraktion durchgeführt. Die Ergebnisse wurden mit 12 % Harnstoff-PAGE analysiert und anhand der Fluorescein-Fluoreszenz sichtbar gemacht.

AbCas12g wurde in E. coli NiCo 21 DE3 unter Verwendung von pET28a-mH6-Cas12g1 (Addgene-Plasmid, 120879) exprimiert und zunächst wie zuvor beschrieben gereinigt25. Das Protein wurde dann durch Pufferaustausch in Puffer mit niedrigem Salzgehalt (25 mM HEPES pH 7,8, 50 mM NH4Cl, 2 mM MgCl2, 7 mM BME, 5 % Glycerin) überführt und über Heparin geladen, gefolgt von der Elution mit einem linearen NaCl-Gradienten Gelfiltration wie zuvor beschrieben62. Gereinigtes Protein wurde schockgefroren und bei –80 °C gelagert. Das Cas12g1-nichtkodierende Plasmid pACYC-Cas12g1 (Addgene-Plasmid, 120880) wurde als Matrize für die PCR-Amplifikation der AbCas12g-tracrRNA-Sequenz mit Cas12gtracrRNA-F- und -R-Primern (Ergänzungstabellen 1 und 3) in 2 × Taq Master Mix (New England) verwendet Biolabs). Das nichtkodierende Plasmid wurde mit DpnI durch einstündige Inkubation bei 37 ° C in CutSmart-Puffer (New England Biolabs) entfernt. DNA-Komponenten wurden nach PCR und DpnI-Verdau mit dem EZNA Cycle Pure Kit (OMEGA BioTek) gereinigt. Die Cas12g-tracrRNA wurde mit dem HighScribe T7 Quick High Yield RNA-Synthesekit transkribiert und mit dem Monarch RNA Cleanup Kit (New England Biolabs) gereinigt. Reaktionen (10 μl), die 250 nM Cas12g, 500 nM Cas12g-crRNA und 1 μΜ Cas12g-tracrRNA in 1 × NEB 3.1-Puffer enthielten, wurden bei 37 °C oder 50 °C mit 200 nM verschiedener Zielsubstrate (ssDNA, dsDNA) inkubiert , RNA) und 100 nM verschiedener FAM-markierter Kollateralsubstrate (ssDNA, dsDNA, RNA). Nach einer Stunde wurden die Reaktionen durch Phenol gestoppt und eine Phenol-Chloroform-Extraktion durchgeführt. Die Ergebnisse wurden mit 12 % Harnstoff-PAGE analysiert und anhand der Fluorescein-Fluoreszenz sichtbar gemacht.

Zur Analyse der SuCas12a2-Kollateralaktivität wurden 10-μl-Reaktionen mit 250 nM Cas12a2-crRNA, 200 nM verschiedener Zielsubstrate (ssDNA, dsDNA, ssRNA) und 100 nM verschiedener FAM-markierter Kollateralsubstrate (ssDNA, dsDNA, RNA) in 1× durchgeführt NEB 3.1-Puffer wurde 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Die Reaktionen wurden mit Phenol gestoppt und eine Phenol-Chloroform-Extraktion durchgeführt. Die Ergebnisse wurden mit 12 % Harnstoff-PAGE analysiert und auf Fluorescein sichtbar gemacht.

Cas12a2 (100 nM) wurde mit crRNA (120 nM) in NEB 3.1-Puffer (50 mM Tris-HCl pH 7,9, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 100 µg ml−1 BSA) komplexiert, bevor es mit RNase oder DNase Alert (200) kombiniert wurde nM, IDT) und Ziel-RNA auf die angegebenen Konzentrationen in einer 384-Well-Platte (Greiner Bio-One, 784077) mischen. Eine Hintergrundkontrolle wurde mit nukleasefreiem Wasser anstelle der Ziel-RNA hergestellt. Die Reaktionen wurden auf Reporterfluoreszenz (RNase-Alarm: Anregung 485-20/Emission 528-20, DNAse-Alarm: Anregung 500-20/Emission 560-20) im Laufe der Zeit entweder bei Umgebungsbedingungen (Raumtemperatur) oder bei 37 °C unter Verwendung des überwacht Synergy H4 Hybrid Multimode-Mikroplatten-Reader (BioTek Instruments). Die Steigung des linearen Bereichs (zwischen 5 und 30 Minuten) wurde bei jeder Ziel-RNA-Konzentration mit GraphPad PRISM bestimmt. Der Standardfehler der linearen Anpassung wurde als Proxy für die Standardabweichung verwendet und die Nachweisgrenze wurde wie zuvor beschrieben als 3 × Standardfehler des Wasserhintergrunds berechnet46. Die Nachweisgrenze wurde geschätzt, indem ermittelt wurde, wo die Auftragung von V0 (relative Fluoreszenzeinheiten (RFU)/s) gegenüber der Konzentration der Ziel-RNA die Nachweisschwelle überschreitet.

Plasmidspaltungsreaktionen wurden durch Kombination von 14 nM SuCas12a2 (oder Mutante) mit 14 nM crRNA und 25 mM Ziel-RNA in NEB 3.1-Puffer (50 mM Tris-HCl pH 7,9, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 100 µg ml−1 BSA) vorbereitet ). Das Protein wurde vor der Zugabe von 7 nM superspiralisiertem pUC19-Plasmid 15 Minuten lang auf 37 °C vorgewärmt. Die Proben wurden zu den Zeitpunkten 1, 2, 5, 10, 20, 30, 45 und 60 Minuten entnommen und in Phenol-Chloroform mit einem pH-Wert von 8,0 gequencht. Abgeschreckte Reaktionen wurden durch Rühren gemischt und anschließend zentrifugiert. Die Proben wurden auf 1 %ige Agarosegele geladen und mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Gele wurden mit dem ChemiDoc MP Image System (Bio-Rad) abgebildet.

Das Plasmid pSPC421 wurde mit dem ZymoPURE II Plasmid Midiprep Kit von Zymo Research (D4201) aus TOP10 E. coli-Zellen gesammelt und mit dem DNA Clean & Concentrator-5 Kit von Zymo Research (D4013) gereinigt. ca33Cas12a2 wurde aus dem Plasmid pCBS5042 exprimiert und wie oben beschrieben am Rudolf Virchow Center for Integrative and Translational Bioimaging gereinigt. ca33Cas12a2-Nuklease (100 nM) wurde mit der crRNA (1 µM) im NEB3.1-Puffer 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. CAO1-Ziel-RNA (1 nM) und pSPC425 (3 µg) wurden 15 Minuten lang zum Reaktionsmedium gegeben. Zur Bewertung des Plasmid-Nicking wurden die Proben zwischen 1 und 30 Minuten auf 80 °C erhitzt. Die Reaktionen wurden auf einem 0,8 %igen Agarosegel durchgeführt. DNA-Polymerase I (NEB, M0209L) wurde der Reaktion (0,2 U µl−1) mit dem Atto421-NT-Markierungsmix (1×) und NT-Markierungspuffer (1×) aus dem Atto425 NT Labeling Kit (Jena Bioscience, PP) zugesetzt -305S-425). Die Proben wurden 90 Minuten lang bei 15 °C in einem Bio-Rad-Thermocycler inkubiert. Die resultierenden markierten DNA-Fragmente wurden mit den Microspin S-400 HR-Säulen (Cytiva, 27514001) gereinigt. Fluoreszenzmessungen (𝛌exc = 436 nm; 𝛌em = 484 nm) wurden auf einem Fluoreszenz-Mikrotiterplattenlesegerät (BioTek NeoG2) bei 25 °C durchgeführt.

Das SuCas12a2-Expressionsplasmid pCBS3568, das die Nuklease- und crRNA-kodierenden Sequenzen enthielt, und die Nicht-crRNA-Kontrolle pCBS3569 wurden in E. coli BL21(AI) transformiert und die Transformanten auf Selektionsplatten ausplattiert. Die resultierenden Kolonien wurden gepflückt und zur Beimpfung von 2 ml Flüssigkulturen über Nacht verwendet. Am nächsten Tag wurden die Übernachtkulturen verwendet, um 25 ml LB mit Chloramphenicol auf eine OD600 von etwa 0,05 zu beimpfen. Sobald die wachsenden Kulturen nach etwa 40 Minuten eine OD600 von 0,25 erreichten, wurde die Expression der Nuklease und der crRNA mit 1 mM IPTG und 0,2 % l-Arabinose induziert. Die induzierten Kulturen wurden in der stationären Phase durch 2-minütige Zentrifugation bei 14.000 U/min und 4 °C gesammelt. Die Zellpellets wurden dann sofort in flüssigem N2 eingefroren und bis zur weiteren Verarbeitung bei −80 °C gelagert.

Die Gesamt-RNA wurde aus Zellpellets unter Verwendung des Direct-zol RNA Miniprep Plus (Zymo Research, R2072) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Die DNA wurde mit Turbo DNase (Life Technologies, AM2238) entfernt. Zwischen den einzelnen Verarbeitungsschritten wurde die RNA mit dem RNA Clean & Concentrator Kit (Zymo Research, R1017) gereinigt. Ribosomale RNA wurde aus den Proben mit dem RiboMinus Transcriptome Isolation Kit, Bakterien (Thermo Fisher Scientific, K155004) entfernt. 3'-Phosphorylgruppen wurden mit T4-Polynukleotidkinase (New England Biolabs, M0201S) aus der RNA entfernt. Die cDNA-Synthese und Bibliotheksvorbereitung wurde mit dem NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set für Illumina (New England Biolabs, E7330S) durchgeführt. Die Größenauswahl für Fragmente zwischen 200 bp und 700 bp wurde mit dem Select-a-Size DNA Clean & Concentrator Kit (Zymo Research, D4080) durchgeführt. Schließlich wurde die DNA mit AMPure XP-Perlen (Beckman Coulter, A63882) gereinigt und mit dem Qubit dsDNA HS-Assay-Kit (Thermo Fisher Scientific, Q32851) auf DeNovix DS-11 FX (DeNovix) quantifiziert.

Die Bibliothekssequenzierung wurde in der GMAK-Einrichtung des Helmholtz-Zentrums für Infektionsforschung (HZI) in Braunschweig unter Verwendung der MiSeq 300-Sequenzierungsmethode (Illumina) durchgeführt. Die resultierenden Paired-End-Lesevorgänge wurden mit BBTools63 (https://sourceforge.net/projects/bbmap/) qualitätskontrolliert, beschnitten und zusammengeführt. Als nächstes wurden die Lesevorgänge mithilfe von Bowtie2 (http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/) auf die crRNA-Expressionsstelle auf dem Plusstrang von pCBS273 abgebildet. Die zugehörigen rohen und verarbeiteten Sequenzierungsdaten sowie die Datenverarbeitungsschritte finden Sie im NCBI Gene Expression Omnibus (GEO: GSE178531).

Standard-Plasmid-Clearance-Assays wurden in E. coli BL21(AI) durchgeführt, das Nuklease- und crRNA-exprimierende Plasmide enthielt. Bakterienkulturen wurden über Nacht gezüchtet und zur Beimpfung von frischem LB-Medium mit Chloramphenicol bis zu einer OD600 von 0,05–0,1 verwendet. Anschließend wurden diese Kulturen gezüchtet, bis die OD600 etwa 0,25 erreichte. Zu diesem Zeitpunkt wurden 1 mM IPTG und 0,2 % l-Arabinose zur Induktion hinzugefügt. Sobald die Kulturen eine OD600 von 0,6–0,8 erreichten, wurden die Zellen gesammelt und elektrokompetent gemacht64. Elektrokompetente Zellen wurden aus vier biologischen Replikaten hergestellt. Unmittelbar danach wurden 1 µl von 50 ng µl−1 des Ziel- und Nicht-Zielplasmids in 50 µl der elektrokompetenten E. coli-Zellen elektroporiert. Um hohe Transformationseffizienzen zu erreichen, wurden die verwendeten Plasmide durch Ethanolfällung gereinigt und mit dem Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Q32851) quantifiziert. Die elektroporierten Zellen wurden 1 Stunde lang bei 37 °C unter Schütteln in 500 µl LB mit 1 mM IPTG und 0,2 % L-Arabinose ohne Antibiotika gewonnen. Anschließend wurden die Kulturen nacheinander in zehnfachen Schritten auf 10–5 verdünnt. Anschließend wurden 5–10 µl jeder Verdünnung auf LB-Platten mit Antibiotika getupft, um die Nuklease-crRNA und die Ziel-/Nicht-Ziel-Plasmide auszuwählen. Die Platten enthielten außerdem 0,3 mM IPTG und 0,2 % L-Arabinose. Die Platten wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert.

Am nächsten Tag wurden die Kolonien manuell gezählt und die resultierenden Zählungen an den Verdünnungsfaktor angepasst. Zählungen aus der höchsten zählbaren Verdünnung wurden verwendet, um die Transformationsfaltenreduktion als Verhältnis zwischen den Kolonien im Nicht-Zielzustand dividiert durch die Kolonien im Zielzustand zu berechnen.

In einer Modifikation des Assays zur Bestimmung des Zellselbstmord-Phänotyps wurden die Ziel- und Nicht-Zielplasmide zunächst in E. coli BL21(AI) transformiert. Als nächstes wurden diese Zellen elektrokompetent gemacht und zuletzt wurden die Nuklease-crRNA-Plasmide transformiert.

Beim Testen von Acrs wurden das Acr-Plasmid (Ampicillin) und das Nuklease-crRNA-Plasmid (Chloramphenicol) co-transformiert, gefolgt von einer Elektroporation des Ziel- oder Nicht-Ziel-Plasmids (Kanamycin).

Um das Wachstum der Kulturen unter Nuklease-Targeting-Bedingungen zu untersuchen, wurden die Nuklease-crRNA und die Ziel-/Nicht-Ziel-Plasmide in E. coli BL21(AI) transformiert. Die resultierenden Transformanten wurden in SOC-Medium gewonnen und über Nacht mit 0,2 % Glucose gezüchtet, um die Nuklease- und crRNA-Expression zu hemmen. Am Morgen wurden die Zellen durch 2-minütige Zentrifugation bei 5.000 g gesammelt. Die Pellets wurden in LB resuspendiert und zum Animpfen von 200 µl LB-Medium auf einer Platte mit 96 Vertiefungen verwendet, um eine endgültige OD600 von 0,01 zu erreichen. Je nach Experiment enthielten die Reaktionen unterschiedliche Kombinationen von Antibiotika, IPTG und L-Arabinose. Die Platten wurden im Plattenlesegerät BioTek Synergy H1 bei 37 °C unter kräftigem Schütteln inkubiert. Die OD600 der Kulturen wurde alle 3 Minuten aufgezeichnet. Plasmid-Clearance-Assays wurden mit den Übernachtkulturen wie oben beschrieben durchgeführt.

Um die PFS-Präferenzen von SuCas12a2 zu bestimmen, wurde ein PFS-Depletionstest durchgeführt. Eine Oligobibliothek (ODpr23), die aus 1.024 Nukleotidkombinationen anstelle einer 5-Nukleotid-PFS-kodierenden Stelle besteht, wurde von Integrated DNA Technologies synthetisiert. Unter Verwendung der ODpr23-Oligo-Pool-Bibliothek in Kombination mit dem Primer ODpr24 wurde das Targeting-Plasmid pCBS276 mittels Q5-Polymerase (New England Biolabs, M0543) PCR-amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden mit dem Zymoclean Gel DNA Recovery Kit (Zymo Research, D4007) gelgereinigt und mit dem KLD-Reaktionsmix (New England Biolabs, M0554) ligiert. Die ligierten Plasmide wurden mittels Ethanolpräzipitation gereinigt und in E. coli TOP10 elektroporiert. Insgesamt wurden zehn Elektroporationsreaktionen durchgeführt. Nach der Gewinnung der elektroporierten Zellen im SOC-Medium wurden die einzelnen Reaktionen kombiniert, um 90 ml LB-Medium mit Kanamycin anzuimpfen. Insgesamt 10 µl aus jeder Elektroporationsreaktion wurden auf selektivem LB-Medium ausplattiert, um die Gesamtzahl der transformierten Bakterien abzuschätzen. Anhand der Koloniezahlen schätzten wir, dass die Gesamtzahl der transformierten Zellen die Zahl der eindeutigen PAM-Sequenzen in der Bibliothek (1.024) um etwa das 2.300-fache überstieg. Die DNA der Plasmidbibliothek wurde aus der kombinierten Übernachtkultur mit dem ZymoPURE II Plasmid Midiprep Kit (Zymo Research, D4201) gereinigt und zusätzlich durch Ethanolfällung gereinigt. Als nächstes wurde die Plasmidbibliothek durch Sanger-Sequenzierung verifiziert.

Die PAM-Plasmidbibliothek wurde in elektrokompetentes E. coli BL21(AI) transformiert, das entweder das SuCas12a2-Nuklease-exprimierende Plasmid pCBS273 oder ein leeres Kontrollplasmid pCBS3569 enthielt. Die elektrokompetenten Zellen wurden wie oben beschrieben hergestellt. Ungefähr 600 ng der Plasmid-DNA wurden in 50 µl Volumen der kompetenten Zellen elektroporiert. Die transformierten Bakterien wurden in 500 µl SOC-Medium für 1 Stunde bei 37 °C gewonnen und zur Beimpfung von 50 ml LB mit 1 mM IPTG und 0,2 % l-Arabinose in Gegenwart von Kanamycin und Chloramphenicol verwendet. Die Kulturen wurden 13 Stunden lang gezüchtet, bevor die Zellen durch 15-minütige Zentrifugation bei 4.000 g gesammelt und die Plasmid-DNA mit dem ZymoPURE II Plasmid Midiprep Kit (Zymo Research, D4201) extrahiert wurden. Nach der Genesung wurden die Bakterien auch auf LB-Platten ausplattiert, die Kanamycin und Chloramphenicol ohne die Induktoren enthielten. Diese Platten wurden verwendet, um die Gesamtzahl der mit der Plasmidbibliothek transformierten Zellen abzuschätzen. Die auf der Grundlage der Koloniezahlen geschätzte Gesamtzahl der transformierten Zellen überstieg die Anzahl der eindeutigen PAM-Sequenzen in der Bibliothek um etwa das 1.700-fache für die Zellen, die das SuCas12a2-crRNA-Plasmid (pCBS273) enthielten, verglichen mit dem 11.900-fachen bei der Kontrolle ohne crRNA (pCBS3569).

Der Bereich der Plasmid-DNA, der die Zielstelle einschließlich der PFS-kodierenden Sequenz enthält, wurde unter Verwendung der Primer ODpr55 und ODpr56 PCR-amplifiziert. Die PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von AMPure XP-Perlen (Beckman Coulter, A63882) gereinigt. Die gereinigten PCR-Produkte wurden mit den Primern ODpr58, ODpr60, ODpr59 und ODpr61 indiziert. Die indizierten PCR-Produkte wurden mithilfe der AMPure XP-Perlen gereinigt, mithilfe des Qubit-Assays (Thermo Fisher Scientific, Q32851) quantifiziert und zur Sequenzierung an die HZI GMAK-Einrichtung mithilfe der MiSeq PE300 Illumina-Sequenzierungsmethode gesendet.

Die Analyse der PFS-kodierenden Sequenzdepletionsdaten sowie die Erstellung der PFS-Räder wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt65. PFS-Konsensmotive wurden manuell definiert. Die rohen und verarbeiteten Sequenzierungsdaten sowie die Datenverarbeitungsschritte finden Sie beim NCBI GEO (GSE178530). Einzelne PFS-Sequenzen wurden mithilfe von Plasmid-Clearance-Assays wie oben beschrieben validiert.

Für In-vitro-Assays zum Testen der Acr-Empfindlichkeit von Cas12a-Nukleasen wurden Plasmide, die Cas12a-Nuklease kodieren, zusammen mit einem Plasmid, das entweder eine Ziel- oder Nicht-Ziel-cRNA kodiert, in 9 µl MyTXTL-Mastermix (Arbor Biosciences) bei einer Endkonzentration von 4 vorexprimiert nM für jedes Plasmid in einem Gesamtvolumen von 12 µl. Acrs wurden separat in einer Konzentration von 4 nM in einem Gesamtvolumen von 12 µl vorexprimiert. Da die Acrs auf linearen DNA-Fragmenten kodiert sind, wurde GamS in einer Endkonzentration von 2 µM hinzugefügt, um den DNA-Abbau zu verhindern. Alle Vorexpressionen wurden 16 Stunden lang bei 29 °C durchgeführt. Der anschließende Spaltungstest wurde durchgeführt, indem 1 µl jeder Vorexpressionsreaktion zu 9 µl frischer myTXTL-Mischung hinzugefügt wurde. Das Plasmid pCBS420, das das deGFP-Protein konstitutiv exprimiert, wurde als Reporter in einer Endkonzentration von 1 nM verwendet. Zur Quantifizierung wurden vier 3-µl-Replikate pro Reaktion auf eine V-Bodenplatte mit 96 Vertiefungen (Corning Costar 3357) übertragen. Die Reaktionen wurden mit dem Echo 525 Liquid Handler (Beckman Coulter) vorbereitet. Die Fluoreszenz wurde mit dem Plattenlesegerät BioTek Synergy H1 gemessen (Anregung 485/20; Emission 528/20). Zeitverlaufsmessungen wurden 16 Stunden lang bei 29 °C durchgeführt, mit 3-Minuten-Intervallen zwischen den Messungen.

Alle Fold-Repression-Werte für Plasmid-Reporter-Konstrukte stellen das Verhältnis der deGFP-Konzentrationen nach 16-stündiger Reaktion für die Nicht-Ziel-crRNA gegenüber der Ziel-crRNA dar. Für die Experimente zur Messung der Hemmaktivität von Acrs wurde die Hemmung anhand der Endpunkt-Expressionswerte nach 16 Stunden Expression gemäß der folgenden Formel66 berechnet: Prozentuale Hemmung der Nukleaseaktivität = 100 × (RFUt,Acr/RFUnt,Acr − RFUt,- /RFUnt,-)/(1 − RFUt,-/RFUnt,-), wobei die Hemmung der Nukleaseaktivität (%) durch das Verhältnis der Fluoreszenz zwischen GFP-Targeting- (t) und nicht-Targeting-Cas-Nukleasen (nt) in definiert ist die Anwesenheit (Acr) und Abwesenheit (-) von Acrs.

Um die RecA-abhängige SOS-Antwort zu messen, wurden die Nuklease-crRNA, die Ziel-/Nicht-Ziel-Plasmide (pCBS276/pCBS3578, Kanamycin) und die Reporter-PrecA-gfp/no-gfp-Plasmide (pCBS3611/pCBS3616, Ampicillin) in E. transformiert . coli BL21(AI) nacheinander. Die Plasmide pCBS273 und pCBS3588 (Chloramphenicol) wurden zur Expression der Nukleasen SuCas12a2 bzw. LbCas12a verwendet. Bei der Messung der RecA-abhängigen SOS-Antwort in Gegenwart von LsCas13a wurde das Nuklease-Expressionsplasmid pCBS361 (Chloramphenicol) verwendet. Es wurden die Ziel-/Nicht-Ziel-Plasmide pCBS2004/pCBS612 (Ampicillin) und die PrecA-gfp/no-gfp-Plasmide pCBS2000/pCBS2002 (Kanamycin) verwendet. Zunächst wurden die Zellen in LB-Medium mit 0,2 % Glucose gezüchtet, um die Expression der Nukleasen und der crRNA zu hemmen. Die Bakterien wurden aus den Übernachtkulturen (15 ml) durch 2-minütige Zentrifugation bei 5.000 g gesammelt und in frischem LB resuspendiert. Als nächstes wurden 200 µl frisches LB-Medium auf 96-Well-Platten mit den resuspendierten Bakterien aus den Übernachtkulturen inokuliert. Diese Kulturen wurden entweder in Gegenwart von Chloramphenicol, Kanamycin und Ampicillin, Chloramphenicol und Ampicillin oder ohne Antibiotika gezüchtet. Zur Induktion der Nuklease- und crRNA-Expression wurden 1 mM IPTG und 0,2 % l-Arabinose zugesetzt.

Die Kulturen wurden bei 37 °C unter kräftigem Schütteln gezüchtet. OD600- und Fluoreszenzmessungen (Anregung: 485/20, Emission: 528/20) wurden alle 5 Minuten auf dem Plattenlesegerät BioTek Synergy H1 erfasst. Pro Versuchsbedingung wurden vier biologische Replikate gemessen.

Um festzustellen, ob eine Änderung der Fluoreszenz als Folge des Nuklease-Targetings auftrat, wurde zunächst die Hintergrundfluoreszenz, die für die Kulturen mit dem PrecA-no-gfp-Plasmid (pCBS3616/pCBS2002) gesammelt wurde, von den Werten abgezogen, die für die Kulturen mit GFP-exprimierendem Plasmid erhalten wurden Plasmide für jeden Zeitpunkt (pCBS3611/pCBS2000). Als nächstes wurden die Fluoreszenzwerte durch die OD600-Werte der entsprechenden Ziel- und Nichtzielkulturen dividiert. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des Welch-T-Tests mit ungleicher Varianz bestimmt.

Parallel dazu führten wir einen Plasmid-Clearance-Assay mit den gewaschenen Übernachtkulturen durch (ergänzende Abbildung 9b), wie oben beschrieben. Für die niedrigste ausplattierte Verdünnung wurden Kulturen mit einer OD600 von etwa 0,1 verwendet.

Für die Durchflusszytometriemessungen wurden E. coli BL21(AI)-Zellen nacheinander mit den Nuklease-kodierenden und Ziel-/Nicht-Ziel-Plasmiden elektroporiert. Es wurden die SuCas12a2- und LbCas12a-exprimierenden Plasmide pCBS273 bzw. pCBS3588 verwendet. Es wurden das Zielplasmid pCBS273 und das Nichtzielplasmid pCBS3578 verwendet. Für die Experimente mit LsCas13a wurde das Nuklease-Expressionsplasmid pCBS361 in Kombination mit dem Zielplasmid pCBS2004 und dem Nicht-Zielplasmid pCBS612 verwendet. Nach der Plasmidtransformation wurden die E. coli-Bakterien in SOC-Medium gewonnen und über Nacht in LB mit Chloramphenicol, Kanamycin und 0,2 % Glucose gezüchtet. Anschließend wurden die Zellen 2 Minuten lang bei 5.000 g gesammelt und in frischem LB resuspendiert. Die resuspendierten Bakterien wurden zur Beimpfung von 15-ml-Kulturen auf eine OD600 von etwa 0,01 verwendet. Diese Kulturen wurden bei 37 °C unter Schütteln bei 220 U/min 6 Stunden lang ohne Antibiotika mit 1 mM IPTG und 0,2 % l-Arabinose gezüchtet. Alle 2 Stunden wurde die OD600 der Kulturen gemessen und 500 µl-Proben gesammelt und 3 Minuten lang bei 5.000 g zentrifugiert. Die Zellpellets wurden dann in 1× PBS mit 2 µg ml−1 DAPI (Thermo Fisher Scientific, 62248) resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden 10 Minuten lang im Dunkeln gefärbt, danach wurden 10 µl in 240 µl 1× PBS auf einer 96-Well-Platte überführt. Die DAPI-Fluoreszenz wurde mit dem Durchflusszytometer Cytoflow Novozyten Quanteon als Emission im Pacific Blue-Spektrum (455 nm) gemessen. Es wurden auch Daten zur Vorwärtsstreuung (FSC) und zur Seitenstreuung gesammelt.

Die resultierenden Daten wurden in Python analysiert. Zunächst wurden Bakteriencluster, die unterschiedliche FSC- und Pacific Blue-Signale aufweisen, mithilfe einer dichtebasierten räumlichen Clusterung von Anwendungen mit Rauschen identifiziert (DBSCAN; https://scikit-learn.org/stable/modules/generated/sklearn.cluster.DBSCAN.html). ). Als nächstes wurden die Verhältnisse des Pacific Blue-Signals zum FSC-Signal für jeden Datenpunkt und der Prozentsatz der Datenpunkte innerhalb jedes Clusters aus den Clustering-Daten analysiert. Die resultierenden Werte wurden in Form von Ballondiagrammen aufgetragen. Insgesamt wurden 60.000 Ereignisse pro Probe analysiert.

Abgestorbene und lebensfähige Bakterien wurden mithilfe des LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability and Counting Kit (Molecular Probes, L34856) geschätzt. Die Messungen wurden mit dem Durchflusszytometer Cytoflow Novozyten Quanteon durchgeführt. E. coli BL21(AI)-Bakterien wurden mit Nuklease, crRNA und entweder Ziel- oder Nicht-Ziel-Expressionsplasmiden transformiert. Zur Expression von SuCas12a2 und LbCas12a mit einem Zielführer wurden die Plasmide pCBS273 bzw. pCBS3588 verwendet. Es wurden das Ziel-Expressionsplasmid pCBS2004 und das Nicht-Ziel-Expressionsplasmid pCBS612 verwendet. Zur Expression von LsCas13a mit Ziel- und Nicht-Ziel-Guides wurden die Plasmide pCBS273 bzw. pCBS3578 verwendet. Kulturen, die Kombinationen aus Nuklease-Leit- und Zielplasmiden enthielten, wurden etwa 16 Stunden lang mit 0,2 % Glucoseinhibitor in vier biologischen Replikaten gezüchtet. Anschließend wurde 1 ml jeder Kultur durch 3-minütige Zentrifugation bei 5.000 g gesammelt. Das resultierende Pellet wurde in 1 ml frischem LB-Medium resuspendiert. Insgesamt 60 µl dieser Suspension wurden zur Beimpfung von 20 ml LB verwendet. Drei Kulturen wurden 2 Stunden lang bei 37 °C unter ständigem Schütteln bei 220 U/min gezüchtet. Die Expression der Nukleasen und der Guides wurde mit 0,2 % Arabinose und 0,01 mM IPTG induziert. Nach 4 Stunden wurde die OD600 der Kulturen gemessen. Ein Volumen der Kulturen, das einer OD600 von 1,0 entspricht, wurde gesammelt und wie im Kit-Handbuch beschrieben verarbeitet. Kurz gesagt wurden Proben der Bakterienkultur 3 Minuten lang bei 10.000 g zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet in 1 ml 0,85 % NaCl resuspendiert. Als Kontrolle für die toten Zellen wurde Spectatpellet zunächst in 300 μl 0,85 % NaCl und dann 700 μl 70 % Isopropylalkohol (Suspension toter Zellen) resuspendiert. Die Proben wurden 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, wobei alle 15 Minuten gemischt wurde. Anschließend wurden die Proben 3 Minuten lang bei 10.000 g zentrifugiert und in 1 ml 0,85 % NaCl gewaschen, gefolgt von einer weiteren Zentrifugation. Abschließend wurden die Proben in 0,5 ml 0,85 % NaCl resuspendiert. Ein Milliliter des Mastermixes zum Färben der Zellen enthielt 977 µl 0,85 % NaCl, 1,5 µl Komponente A (3,34 mM SYTO 9-Nukleinsäurefärbung), 1,5 µl Komponente B (30 mM Propidiumiodid (PI)), 10 µl Komponente C (Beads) und 10 µl der Probe. Diese Reaktionen wurden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt inkubiert. Die Fluoreszenz wurde im grünen (Fluorescein für SYTO 9) und roten (Texas Red für PI) Kanal gesammelt. Die toten Zellen in jeder Probe wurden auf der Grundlage der mit Isopropylalkohol behandelten Suspensionskontrolle toter Zellen isoliert. Der Prozentsatz der mit PI gefärbten toten Zellen wurde aus der Gesamtzahl der Ereignisse ohne die Kügelchen berechnet. Pro Probe wurden insgesamt 50.000 Ereignisse gezählt.

Proben, die 1 ml Kultur mit einer OD600 von 0,4 entsprachen, die wie oben beschrieben für die Tot-/Lebendfärbung gezüchtet wurde, wurden gesammelt und 3 Minuten lang bei 10.000 g zentrifugiert. Die resultierenden Pellets wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur weiteren Verarbeitung bei −80 °C gelagert. Die Gesamt-RNA wurde mit 1,5 ml Trizol und 1,5 ml Ethanol mit dem Direct-zol RNA Miniprep Kit (R2051, Zymo) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die RNA wurde mit dem RNA Clean & Concentrator-5 Kit (R1013, Zymo) weiter gereinigt. Insgesamt 0,5 µg RNA aus jeder Probe in 5 µl wurden mit 2,5 µl RNA-Beladungsfarbstoff kombiniert, 10 Minuten lang auf 70 °C erhitzt und anschließend 2 Minuten lang auf Eis gekühlt. Die verwendete RNA-High-Range-Leiter wurde ebenfalls wärmebehandelt. Die denaturierten Proben (5 µl) und der Leader (3 µl) wurden auf ein 1 % TBE-Gel geladen. Das Gel wurde 40 Minuten lang bei 120 V betrieben. Anschließend wurde das Gel 30 Minuten lang in Ethidiumbromid gefärbt, 10 ml lang gewaschen und abgebildet. Gelbilder wurden mit GelAnalyzer v.19.1 (www.gelanalyzer.com) analysiert.

Für die konfokale Mikroskopie wurden die Zellen wie oben für die Durchflusszytometrie beschrieben gezüchtet. In Abständen von 2 Stunden wurden 500 µl jeder Kultur gesammelt und 3 Minuten lang bei 5.000 g zentrifugiert. Als nächstes wurden die Bakterien auf ungefähr die gleiche Zelldichte verdünnt und mit 2 µg ml−1 FM4-64-Farbstoff (Thermo Fisher Scientific, T13320) und 1 µg ml−1 DAPI (Thermo Fisher Scientific, 62248) angefärbt. Die Bildgebung wurde mit dem invertierten konfokalen Mikroskop Leica DMi6000B TCS-SP5 II bei 1.000-facher Vergrößerung durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die NGS-Daten aus dem PAM-Depletion-Assay und die crRNA-Sequenzierungsdaten wurden beim NCBI GEO unter dem Zugangscode GSE178536 hinterlegt. Alle anderen Daten, die die Ergebnisse des Artikels und der ergänzenden Informationen stützen, sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

Lopatina, A., Tal, N. & Sorek, R. Abortive Infektion: bakterieller Selbstmord als antivirale Immunstrategie. Annu. Rev. Virol. 7, 371–384 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Koonin, EV & Krupovic, M. Ursprung des programmierten Zelltods durch antivirale Abwehr? Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 116, 16167–16169 (2019).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Meeske, AJ, Nakandakari-Higa, S. & Marraffini, LA Cas13-induzierte Zellruhe verhindert die Entstehung von CRISPR-resistenten Bakteriophagen. Natur 570, 241–245 (2019).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Rostøl, JT & Marraffini, LA Der unspezifische Abbau von Transkripten fördert die Plasmid-Clearance während der Typ-III-A-CRISPR-Cas-Immunität. Nat. Mikrobiol. 4, 656–662 (2019).

Artikel Google Scholar

Rostøl, JT et al. Die Card1-Nuklease sorgt für die Abwehr während der CRISPR-Immunität vom Typ III. Natur 590, 624–629 (2021).

Artikel ADS Google Scholar

VanderWal, AR, Park, J.-U., Polevoda, B., Kellogg, EH & O'Connell, MR CRISPR-Csx28 bildet eine Cas13b-aktivierte Membranpore, die für eine robuste adaptive CRISPR-Cas-Immunität erforderlich ist. Vorabdruck bei bioRxiv https://doi.org/10.1101/2021.11.02.466367 (2021).

Gootenberg, JS et al. Nukleinsäurenachweis mit CRISPR-Cas13a/C2c2. Wissenschaft 356, 438–442 (2017).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Abudayyeh, OO et al. C2c2 ist ein einkomponentiger programmierbarer RNA-gesteuerter RNA-Targeting-CRISPR-Effektor. Wissenschaft 353, aaf5573 (2016).

Artikel Google Scholar

Kazlauskiene, M., Kostiuk, G., Venclovas, Č., Tamulaitis, G. & Siksnys, V. Ein zyklischer Oligonukleotid-Signalweg in CRISPR-Cas-Systemen vom Typ III. Wissenschaft 357, 605–609 (2017).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Niewoehner, O. et al. CRISPR-Cas-Systeme vom Typ III produzieren zyklische Oligoadenylat-Second Messenger. Natur 548, 543–548 (2017).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Makarova, KS, Anantharaman, V., Grishin, NV, Koonin, EV & Aravind, L. CARF- und WYL-Domänen: Ligandenbindungsregulatoren prokaryotischer Abwehrsysteme. Vorderseite. Genet. 5, 102 (2014).

Artikel Google Scholar

Lau, RK et al. Struktur und Mechanismus einer zyklischen Trinukleotid-aktivierten bakteriellen Endonuklease, die die Immunität von Bakteriophagen vermittelt. Mol. Zelle 77, 723–733 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Grüschow, S., Adamson, CS & White, MF Spezifität und Empfindlichkeit eines RNA-Targeting-Typ-III-CRISPR-Komplexes gekoppelt mit einem NucC-Endonuklease-Effektor. Nukleinsäuren Res. 49, 13122–13134 (2021).

Artikel Google Scholar

Chen, JS et al. Die CRISPR-Cas12a-Zielbindung löst wahllose einzelsträngige DNase-Aktivität aus. Science 360, 436–439 (2018).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Marino, ND, Pinilla-Redondo, R. & Bondy-Denomy, J. Das CRISPR-Cas12a-Targeting von ssDNA spielt keine erkennbare Rolle bei der Immunität. Nukleinsäuren Res. 50, 6414–6422 (2022).

Artikel CAS Google Scholar

Zetsche, B. et al. Cpf1 ist eine einzelne RNA-gesteuerte Endonuklease eines Klasse-2-CRISPR-Cas-Systems. Zelle 163, 759–771 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Jinek, M. et al. Eine programmierbare dual-RNA-gesteuerte DNA-Endonuklease in der adaptiven bakteriellen Immunität. Wissenschaft 337, 816–821 (2012).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Makarova, KS, Wolf, YI & Koonin, EV Klassifizierung und Nomenklatur von CRISPR-Cas-Systemen: Woher kommt es? CRISPR J. 1, 325–336 (2018).

Artikel Google Scholar

Bravo, JPK et al. RNA-Targeting löst wahllose Nukleaseaktivität von CRISPR-Cas12a2 aus. Natur https://doi.org/10.1038/s41586-022-05560-w (2022).

Fonfara, I., Richter, H., Bratovič, M., Le Rhun, A. & Charpentier, E. Das CRISPR-assoziierte DNA-spaltende Enzym Cpf1 verarbeitet auch Vorläufer-CRISPR-RNA. Natur 532, 517–521 (2016).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Deltcheva, E. et al. CRISPR-RNA-Reifung durch transkodierte kleine RNA und Wirtsfaktor RNase III. Natur 471, 602–607 (2011).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Swarts, DC, van der Oost, J. & Jinek, M. Strukturelle Basis für die Leit-RNA-Verarbeitung und das samenabhängige DNA-Targeting durch CRISPR-Cas12a. Mol. Zelle 66, 221–233 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

East-Seletsky, A. et al. Zwei unterschiedliche RNase-Aktivitäten von CRISPR-C2c2 ermöglichen die Guide-RNA-Verarbeitung und den RNA-Nachweis. Natur 538, 270–273 (2016).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Marshall, R. et al. Schnelle und skalierbare Charakterisierung von CRISPR-Technologien mithilfe eines zellfreien E. coli-Transkriptions-Translationssystems. Mol. Zelle 69, 146–157 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Yan, WX et al. Funktionell vielfältige CRISPR-Cas-Systeme vom Typ V. Wissenschaft 363, 88–91 (2019).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Murugan, K., Seetharam, AS, Severin, AJ & Sashital, DG CRISPR-Cas12a hat weitreichende Off-Target- und dsDNA-Nicking-Effekte. J. Biol. Chem. 295, 5538–5553 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Collias, D. & Beisel, CL CRISPR-Technologien und die Suche nach der PAM-freien Nuklease. Nat. Komm. 12, 555 (2021).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Elmore, JR et al. Die zweiteilige Erkennung von Ziel-RNAs aktiviert die DNA-Spaltung durch das Typ III-B CRISPR-Cas-System. Genes Dev. 30, 447–459 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Kazlauskiene, M., Tamulaitis, G., Kostiuk, G., Venclovas, Č. & Siksnys, V. Raumzeitliche Kontrolle der CRISPR-Cas-Immunität vom Typ III-A: Kopplung des DNA-Abbaus mit der Ziel-RNA-Erkennung. Mol. Zelle 62, 295–306 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Liu, TY, Iavarone, AT & Doudna, JA RNA- und DNA-Targeting durch ein rekonstituiertes Thermus thermophilus Typ III-A CRISPR-Cas-System. PLoS ONE 12, e0170552 (2017).

Artikel Google Scholar

Han, W. et al. Ein CRISPR-Cas-Effektorkomplex vom Typ III-B, der eine massive Zerstörung der Ziel-DNA vermittelt. Nukleinsäuren Res. 45, 1983–1993 (2017).

CAS Google Scholar

Wang, B. et al. Strukturelle Grundlage für die Verhinderung der Selbstspaltung durch Tag:Anti-Tag-Paarkomplementarität in Cas13-CRISPR-Systemen vom Typ VI. Mol. Zelle 81, 1100–1115 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Marraffini, LA & Sontheimer, EJ Selbst- und Nichtselbstdiskriminierung während der CRISPR-RNA-gerichteten Immunität. Natur 463, 568–571 (2010).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Wiedenheft, B. et al. Der RNA-gesteuerte Komplex eines bakteriellen Immunsystems verbessert die Zielerkennung durch Interaktionen mit Samensequenzen. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 108, 10092–10097 (2011).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Semenova, E. et al. Die Interferenz durch Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)-RNA wird durch eine Seed-Sequenz gesteuert. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 108, 10098–10103 (2011).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Watters, KE, Fellmann, C., Bai, HB, Ren, SM & Doudna, JA Systematische Entdeckung natürlicher CRISPR-Cas12a-Inhibitoren. Wissenschaft 362, 236–239 (2018).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Knott, GJ et al. Breitbandige enzymatische Hemmung von CRISPR-Cas12a. Nat. Struktur. Mol. Biol. 26, 315–321 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Marino, ND et al. Entdeckung weit verbreiteter CRISPR-Cas-Inhibitoren vom Typ I und Typ V. Wissenschaft 362, 240–242 (2018).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Dong, L. et al. Ein Anti-CRISPR-Protein deaktiviert Typ V Cas12a durch Acetylierung. Nat. Struktur. Mol. Biol. 26, 308–314 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Little, JW & Mount, DW Das SOS-Regulationssystem von Escherichia coli. Zelle 29, 11–22 (1982).

Artikel CAS Google Scholar

Janion, C. Einige Aspekte des SOS-Reaktionssystems – eine kritische Umfrage. Acta Biochim. Pol. 48, 599–610 (2001).

Artikel CAS Google Scholar

Chen, Z., Lu, M., Zou, D. & Wang, H. Ein E. coli SOS-EGFP-Biosensor für den schnellen und empfindlichen Nachweis von DNA-schädigenden Wirkstoffen. J. Umgebung. Wissenschaft. 24, 541–549 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Vercoe, RB et al. Das zytotoxische Chromosomen-Targeting durch CRISPR/Cas-Systeme kann bakterielle Genome umformen und Pathogenitätsinseln ausstoßen oder umgestalten. PLoS Genet. 9, e1003454 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Cui, L. & Bikard, D. Folgen der Cas9-Spaltung im Chromosom von Escherichia coli. Nukleinsäuren Res. 44, 4243–4251 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Caliando, BJ & Voigt, CA Gezielter DNA-Abbau mit einem CRISPR-Gerät, das stabil im Wirtsgenom getragen wird. Nat. Komm. 6, 6989 (2015).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Huyke, DA et al. Enzymkinetik und Detektorempfindlichkeit bestimmen die Nachweisgrenzen der amplifikationsfreien CRISPR-Cas12- und CRISPR-Cas13-Diagnostik. Anal. Chem. 94, 9826–9834 (2022).

Artikel CAS Google Scholar

Rigby, PW, Dieckmann, M., Rhodes, C. & Berg, P. Markierung von Desoxyribonukleinsäure für hohe spezifische Aktivität in vitro durch Nick-Translation mit DNA-Polymerase IJ Mol. Biol. 113, 237–251 (1977).

Artikel CAS Google Scholar

Nemudraia, A. et al. Die sequenzspezifische Erfassung und Konzentration viraler RNA durch das Typ-III-CRISPR-System verbessert die Diagnostik. Vorabdruck bei Research Square https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-1466718/v1 (2022).

Leenay, RT & Beisel, CL Entschlüsselung, Kommunikation und Entwicklung des CRISPR PAM. J. Mol. Biol. 429, 177–191 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Silas, S. et al. CRISPR-Cas-Systeme vom Typ III können Redundanz bieten, um dem Virusaustritt aus Systemen vom Typ I entgegenzuwirken. eLife 6, e27601 (2017).

Artikel Google Scholar

Estrella, MA, Kuo, F.-T. & Bailey, S. RNA-aktivierte DNA-Spaltung durch den Typ III-B CRISPR-Cas-Effektorkomplex. Genes Dev. 30, 460–470 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Liu, L. et al. Die molekulare Architektur für die RNA-gesteuerte RNA-Spaltung durch Cas13a. Zelle 170, 714–726 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Katoh, K. & Standley, DM MAFFT Multiple Sequence Alignment Software Version 7: Verbesserungen bei Leistung und Benutzerfreundlichkeit. Mol. Biol. Entwicklung 30, 772–780 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Steenwyk, JL, Buida, TJ 3rd, Li, Y., Shen, X.-X. & Rokas, A. ClipKIT: eine Trimmsoftware für die Ausrichtung mehrerer Sequenzen für genaue phylogenomische Schlussfolgerungen. PLoS Biol. 18, e3001007 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Kozlov, AM, Darriba, D., Flouri, T., Morel, B. & Stamatakis, A. RAxML-NG: ein schnelles, skalierbares und benutzerfreundliches Tool für phylogenetische Schlussfolgerungen mit maximaler Wahrscheinlichkeit. Bioinformatik 35, 4453–4455 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Kelley, LA, Mezulis, S., Yates, CM, Wass, MN & Sternberg, MJE Das Phyre2-Webportal für Proteinmodellierung, -vorhersage und -analyse. Nat. Protokoll. 10, 845–858 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Söding, J., Biegert, A. & Lupas, AN Der interaktive HHpred-Server zur Proteinhomologieerkennung und Strukturvorhersage. Nukleinsäuren Res. 33, W244–W248 (2005).

Artikel Google Scholar

Guzman, LM, Belin, D., Carson, MJ & Beckwith, J. Strenge Regulierung, Modulation und Expression auf hohem Niveau durch Vektoren, die den Arabinose-PBAD-Promotor enthalten. J. Bakteriol. 177, 4121–4130 (1995).

Artikel CAS Google Scholar

Studier, FW Proteinproduktion durch Autoinduktion in Schüttelkulturen hoher Dichte. Proteinexpr. Purif. 41, 207–234 (2005).

Artikel CAS Google Scholar

Lapinaite, A. et al. DNA-Erfassung durch einen CRISPR-Cas9-gesteuerten Adeninbase-Editor. Wissenschaft 369, 566–571 (2020).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Harris, CJ, Molnar, A., Müller, SY & Baulcombe, DC FDF-PAGE: eine leistungsstarke Technik, die bisher unentdeckte kleine RNAs sichtbar macht, die durch komplementäre Transkripte gebunden sind. Nukleinsäuren Res. 43, 7590–7599 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Li, Z., Zhang, H., Xiao, R., Han, R. & Chang, L. Kryo-EM-Struktur der RNA-gesteuerten Ribonuklease Cas12g. Nat. Chem. Biol. 17, 387–393 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Bushnell, B., Rood, J. & Singer, E. BBMerge – präzise gepaarte Shotgun-Read-Zusammenführung durch Überlappung. PLoS ONE 12, e0185056 (2017).

Artikel Google Scholar

Green, MR & Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012).

Leenay, RT et al. Identifizierung und Visualisierung der funktionalen PAM-Vielfalt in CRISPR-Cas-Systemen. Mol. Zelle 62, 137–147 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Wandera, KG et al. Ein verbesserter Assay zur Charakterisierung von Anti-CRISPR-Proteinen mithilfe eines zellfreien Transkriptions-Translationssystems. Methoden 172, 42–50 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Referenzen herunterladen

Wir danken K. Makarova für die Anleitung zur Benennung von Cas12a2 und für Feedback zu phylogenetischen Analysen; L. Fläxl für seine Unterstützung bei der Transkription/Übersetzung; L. Ostertag für seine Unterstützung bei der Nick-Übersetzung; F. Ttofali für seine Unterstützung beim Klonen und Testen von Plasmiden; D. Collias für Vorschläge zur Nicking-Übersetzung; und A. Pawluk und A. Özcan für Feedback zum Manuskript. Die Plasmide pET28a-mH6-Cas12g1 (Addgene-Plasmid, 120879) und pACYC-Cas12g1 (Addgene-Plasmid, 120880) waren Geschenke von Arbor Biosciences. Das Plasmid pC001 war ein Geschenk von F. Zhang (Addgene-Plasmid, 79150). Diese Arbeit wurde durch einen ERC Consolidator Grant (865973 an CLB), das DARPA Safe Genes-Programm (HR0011-17-2-0042 an CLB), die National Institutes of Health (R35GM138080 an RNJ) und die niederländische Organisation für wissenschaftliche Forschung ( NWO) durch einen Rubicon Grant (Projekt 019.193EN.032, an IM) und die Federal Agency for Disruptive Innovation (an CLB). Die geäußerten Ansichten, Meinungen und/oder Erkenntnisse sollten nicht so interpretiert werden, dass sie die offiziellen Ansichten oder Richtlinien des Verteidigungsministeriums oder der US-Regierung widerspiegeln.

Open access funding provided by Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH (HZI).

Benjamin N. Gray

Aktuelle Adresse: Syngenta, Research Triangle Park, NC, USA

Helmholtz-Institut für RNA-basierte Infektionsforschung, Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung, Würzburg, Deutschland

Oleg Dmytrenko, Elena Vialetto, Ioannis Mougiakos, Katharina G. Wandera, Johannes Weber, Thomas Gaudin und Chase L. Beisel

Benson Hill, St. Louis, MO, USA

Gina C. Neumann, Benjamin N. Gray und Matthew B. Begemann

Abteilung für Chemie und Biochemie, Utah State University, Logan, UT, USA

Thomson Hallmark, Dylan J. Keiser, Valerie M. Crowley, Hannah Domgaard, Josie Metcalf und Ryan N. Jackson

Medizinische Fakultät, Universität Würzburg, Würzburg, Deutschland

Chase L. Beisel

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Konzeptualisierung: OD, GCN, RNJ und CLB Methodik: OD, GCN, VMC, JM, HD, TH und DJK Bioinformatische Entdeckung von Cas12a2-Orthologen: BNG und OD Erste Beobachtung einer bakteriellen abortiven Infektion: GCN Phylogenetische Analyse: OD Entdeckung des RNA-Targetings: OD-, DJK-, RNJ- und CLB-Experimente in E. coli: OD, GCN, VMC, EV, IM und JW Experimente zur Transkription/Übersetzung: KGW, JW und OD Experimente in vitro: VMC, DJK, HD, TH und JM Nick- Übersetzungsdiagnose: TG Writing – Originalentwurf: OD, VMC, RNJ und CLB Writing – Überprüfung und Bearbeitung: alle Autoren. Visualisierung: OD, DJK, TH, HD, RNJ und CLB Betreuung: MBB, RNJ und CLB Fördermittelakquise: RNJ und CLB

Korrespondenz mit Matthew B. Begemann, Ryan N. Jackson oder Chase L. Beisel.

Benson Hill verfügt über ein erteiltes Patent (US 9.896.696) und hat weitere Patentanträge eingereicht. GCN und MBB sind Mitarbeiter von Benson Hill. OD, RNJ und CLB haben vorläufige Patentanmeldungen für die entsprechenden Konzepte eingereicht und ein Patent erteilt (US 9.896.696). CLB ist Mitbegründer von Locus Biosciences und Mitglied des wissenschaftlichen Beirats von Benson Hill. Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature dankt Raymond Staals und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Der unter Verwendung von Aminosäuresequenzen erstellte phylogenetische Baum ist die kommentierte Version von Abb. 1a. Die schattierten Bereiche bezeichnen die Orthologen Cas12a2 (rot), Cas12a (blau) und Cas12b (grau). Die blau und rot ausgefüllten Kreise zeigen Systeme an, die sowohl Cas12a2 als auch Cas12a enthalten. An den Knoten werden TBE-Werte (Transfer Bootstrap Expectation) angezeigt.

a, Verschiedene Anleitung: Zielpaare, getestet unter Antibiotika-Selektion der Nuklease und der Zielplasmide oder nur des Nukleaseplasmids. b, Reduzierung der Plasmidtransformation durch Cas12a2-Orthologe, getestet unter Antibiotika-Selektion der Nuklease und Zielplasmide. c, Auswirkung des Austauschs direkter Wiederholungen, die mit SuCas12a2- und Cas12a-Nukleasen assoziiert sind, auf die Plasmidtransformation. Die angegebene Nuklease, die für die Wiederholung kodierende crRNA und das Ziel wurden dem traditionellen (links) und dem modifizierten (rechts) Plasmidinterferenztest in E. coli unterzogen. d, Diagramm der Ziel- und Nicht-Zielplasmide, die im in e gezeigten Plasmid-Clearance-Assay verwendet werden. e, Einfluss eines Promotors und eines Terminators stromaufwärts der Zielstelle auf die Plasmid-Clearance durch SuCas12s2 und LbCas12a. f, Diagramm der zellfreien TXTL-Reaktionen, die zur Bewertung des Einflusses der Zielexpression auf die Stummschaltung der Cas12a2-Kollateralen verwendet wurden, dargestellt in g. g, Der Effekt der Kollateral-Stummschaltung durch SuCas12a2 in TXTL als Funktion eines Promotors, keines Promotors oder Terminators stromaufwärts der Zielexpressionsstelle. Streudiagramme stellen Mittelwerte von 4 technischen Replikaten ± Standardabweichung dar. Sofern nicht anders angegeben, handelt es sich bei den Werten um Mittelwerte ± Standardabweichung von mindestens 3 unabhängigen Experimenten, die mit getrennten Kolonien begonnen wurden. ns: p > 0,05, *: p < 0,05, **: p < 0,005 berechnet mit einseitigem Welch-t-Test.

a, Diagramm der vorhergesagten Sekundärstruktur der direkten SuCas12a2-Wiederholung. Die Spaltungsstellen von SuCas12a2 und Cas12a sind angegeben. b, Sequenzierungsabdeckung der cDNA, die auf den crRNA-Locus in E. coli BL21(AI) abgebildet ist, der SuCas12a2 exprimiert. Die Abdeckung aller qualitätsgefilterten Lesevorgänge über 10 nts sowie Lesevorgänge zwischen 10 und 55 nts, die dem Plus-Strang zugeordnet sind, wird angezeigt. c, In-vitro-Verarbeitung einer 56-nt-Prä-crRNA, die 60 Minuten lang in Gegenwart von Apo-SuCas12a2 oder zwei Mutanten inkubiert wurde, von denen vorhergesagt wurde, dass sie die crRNA-Verarbeitung stören. d, In vitro SuCas12a2-vermittelte Spaltung einer Prä-crRNA, die drei direkte Wiederholungen und drei Spacer enthält (3× crRNA). Reaktionen mit Apo-SuCas12a2 sind angegeben. Zeitpunkte nach dem Mischen der Spaltungsreaktion mit Apo-SuCas12a2 sind angegeben. Die geschätzten Größen der prä-crRNA und crRNAs nach der Spaltung sind links angegeben. Die letzten beiden Spuren enthalten RNA, die aus SuCas12a2 extrahiert und mit einem CRISPR-Array koexprimiert wurde. Der Größenunterschied zwischen der Haupt-crRNA-Bande im In-vitro-Assay (~ 67 nt) und der aus SuCas12a2 extrahierten crRNA, die an E. coli-exprimierte crRNA gebunden ist (~ 42), kann auf ein weiteres Trimmen durch 3′-Exonukleasen in der Zelle zurückzuführen sein . Daten zur Gelquelle finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1.

a, Unspezifische Kollateralaktivitäten von SuCas12a2, LbCas12a, LwaCas13a und AbCas12g gegenüber FAM-markierter Nicht-Ziel-ssDNA, dsDNA und RNA in Gegenwart von Ziel-ssDNA, dsDNA und RNA. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Spaltungsreaktionen bei 37 °C durchgeführt. AbCas12g wurde durch RNA und ssDNA ausgelöst und zeigte eine bevorzugte Kollateralspaltung von RNA gegenüber ssDNA, jedoch keine erkennbare Spaltung von dsDNA. b, SuCas12a2-vermittelte Spaltung von FAM-markierten Nicht-Zielsubstraten aus RNA (oben), ssDNA (Mitte) und dsDNA (unten) über die Zeit. Diese Substrate werden von SuCas12a2 durch seine unspezifische Kollateralaktivität gespalten. c: Elektromobilitäts-Shift-Assay, der darauf hinweist, dass SuCas12a2 und LbCas13a dsRNA größtenteils nicht wahllos abbauen. Angegeben sind ungespaltene Substrate und gespaltene Produkte. d, Einfluss mutierender konservierter Cysteine ​​innerhalb der vorhergesagten Zinkfingerdomäne von SuCas12a2 auf die RNA-ausgelöste Kollateralaktivität. Die mutierten Cysteine ​​in SuCas12a2 sind C1170S, C1173S, C1188S und C1191S. e, Elektromobilitäts-Shift-Assays des superspiralisierten pUC19-Plasmids mit SuCas12a2:crRNA und verschiedenen RNA-Sequenzen im Zeitverlauf. Zu den RNA-Sequenzen gehören: Nicht-Selbstziel (komplementär zu gRNA mit 3′-GAAAG-PFS), Zielkomplement (Komplement des Nicht-Selbstziels), Nicht-Ziel (RNA-Sequenz, die in Transspaltungsassays verwendet wird), Kein PFS (RNA, die nur enthält Komplement zu gRNA, kein 3′-PFS), Selbst-PFS (komplementär zu gRNA mit 3′-AUCUA-PFS). RNA-Sequenzen finden Sie in der Ergänzungstabelle 1. SuCas12a2 (E1063A) mit dem Nicht-Selbst-Target ist als Negativkontrolle enthalten. NN: Kontrolle ohne Nuklease. Daten zur Gelquelle finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1.

a, Sequenzierungsabdeckung der PFS-Bibliotheken aus den Ziel- und Kontroll-E. coli-Kulturen. Es werden Daten von zwei biologischen Replikaten angezeigt. b, Korrelation zwischen den aus den beiden Replikatbibliotheken erhaltenen Erschöpfungswerten. c, Das komplexe PFS-Profil, das von SuCas12a2 erkannt wird. Siehe Ref. Weitere Informationen zur Interpretation von PAM-Rädern finden Sie auf Seite 65. Angesichts der Komplexität des PFS-Profils werden vier verschiedene PAM-Räder basierend auf jedem Nukleotid an der PFS-Position –1 gezeigt. d, Validierung ausgewählter PFS-Sequenzen, die im PFS-Screen mit SuCas12a2 identifiziert wurden, unter Verwendung des Plasmid-Clearance-Assays. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung von ≥ 3 unabhängigen Experimenten, die mit getrennten Kolonien begonnen wurden. ns: p > 0,05, *: p < 0,05, **: p < 0,005 berechnet mit einseitigem Welch-t-Test.

a, Einfluss der Führungslänge auf die Plasmid-Clearance. Die Führungssequenz ist mit blauen Buchstaben dargestellt. Die Standardlänge des crRNA-Leitfadens basierend auf der crRNA-Verarbeitung (Extended Data Abb. 3) beträgt 24 nts. b, Reduzierung der Plasmidtransformation durch SuCas12a2 und LbCas12a in Gegenwart eines gemeinsamen PAM/PFS, Cas12a2-spezifischen PFS und Fehlpaarungen zum Ziel unter Zielplasmid- und Nukleaseplasmid- oder Nukleaseplasmid-nur-Selektion. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung von mindestens drei unabhängigen Experimenten, die mit getrennten Kolonien begonnen wurden. ns: p > 0,05, *: p < 0,05, **: p < 0,005 berechnet mit einseitigem Welch-t-Test.

a, 1 % Agarosegel, das Gesamt-RNA auflöst, die aus E. coli BL21(AI) extrahiert wurde, das SuCas12a2, LbCas12a und LsCas13a unter Zielbedingungen (T) und Nichtzielbedingungen (NT) exprimiert. Die Expression der Nukleasen und der crRNA wurde mit 10 nM IPTG und 0,2 % Arabinose für 2 Stunden induziert. Einzelne Vertiefungen für jede Erkrankung stellen biologische Replikate dar. Die Nukleotidgrößen basieren auf einer aufgelösten RNA-Leiter. sRNA-Pool: RNA-Pool bestehend aus tRNAs und anderen kleinen RNAs. b, Quantifizierung der Bandenintensitäten in den 4 unabhängigen experimentellen Replikaten, ausgehend von separaten Kolonien. Die Signifikanz wurde mithilfe des zweiseitigen Welch-t-Tests berechnet (ns: p > 0,05, *: p < 0,05, **: p < 0,005).

Die Kulturen wurden 4 Stunden nach der Inokulation und Induktion von Nuklease und crRNA gesammelt. Vor der Analyse wurden die Zellen mit DAPI gefärbt. Die Subpopulation mit niedrigem DAPI und hoher Vorwärtsstreuung spiegelt längliche Zellen mit reduziertem DNA-Gehalt wider. Konturdiagramme sind repräsentativ für 4 unabhängige Experimente.

Bei den Bakterien, die das Zielexpressionsplasmid enthalten und SuCas12a2 und Ziel-crRNA exprimieren, kann 2 Stunden und 4 Stunden nach der Induktion eine ausgedehnte Filamentierung beobachtet werden. In jedem überlagerten Bild ist die fluoreszierende DNA-Färbung (DAPI) in Blau und die Membranfärbung (FM4–64) in Rot dargestellt. Gepaarte Bilder sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente.

a, Fortschrittskurve für die Ziel-RNA-aktivierte Spaltung des RNA-Beacons durch SuCas12a2 bei 37 °C. b, Nachweisgrenze von SuCas12a2 mit einem RNA-Beacon, bestimmt mit der Geschwindigkeitsmethode46. Die Geschwindigkeiten wurden durch Regressionsanalyse der linearen Bereiche der Verlaufskurven ermittelt. Zur Bestimmung aller gemeldeten Nachweisgrenzen wurde die Geschwindigkeitsmethode verwendet. c, Fortschrittskurve für die Ziel-RNA-aktivierte Spaltung des ssDNA-Beacons durch Cas12a2 bei Umgebungstemperatur (RT). Die Fehlerbalken in a und c stellen den Mittelwert und die Standardabweichung von drei unabhängigen Messungen dar. Fehlerbalken in b stellen den Standardfehler für die lineare Anpassung dreier unabhängiger Messungen dar. d, Übersicht über den Nachweistest basierend auf Plasmid-Nicking und Nick-Translation. e, Aufgelöstes Plasmidsubstrat, inkubiert mit dem ca33Cas12a2-gRNA-RNP (100 nM) und der angegebenen RNA (1 nM). Die Inkubationszeit vor Beginn der Nick-Translation ist für jede Versuchsbedingung angegeben. Die erste Spur (nur Plasmid) stellt das Plasmid dar, das ohne RNP inkubiert wurde. Nicht-Ziel-RNA1: COA1-gRNA und SARS-CoV-2-RNA. Nicht-Ziel-RNA2: SARS-CoV-2-gRNA und COA1-RNA. f, Fluoreszenzmessungen nach Nick-Translation mit den verschiedenen Reaktionen aus e. Die Fluoreszenzwerte wurden auf die der Nur-Plasmid-Kontrolle normalisiert. Für die Positivkontrolle wurde das Plasmid einer Mischung aus DNase I und DNA-Polymerase I ausgesetzt. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung von 3 unabhängigen Experimenten. Die Signifikanz wurde mithilfe des zweiseitigen Welch-t-Tests im Vergleich zu einem Wert von 1 berechnet (ns: p > 0,05, *: p < 0,05, **: p < 0,005). Daten zur Gelquelle finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1.

Daten zur Gelquelle.

Ergänzende Abbildungen. 2–9 und die Legende zur ergänzenden Abbildung 1.

Ergänzungstabellen 1–5.

Fasta-Datei mit den Aminosäuresequenzen von Cas12a2, Cas12a und Cas12b.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Dmytrenko, O., Neumann, GC, Hallmark, T. et al. Cas12a2 löst eine fehlgeschlagene Infektion durch RNA-ausgelöste Zerstörung von dsDNA aus. Natur 613, 588–594 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05559-3

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Eingegangen: 13. Juni 2022

Angenommen: 11. November 2022

Veröffentlicht: 04. Januar 2023

Ausgabedatum: 19. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05559-3

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Natur (2023)

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